Trên phổ hồng ngoại và phổ 1
hưởng từ hạt nhân H-NMR vùng tín hiệu H6 là 1,2 ppm-1,3 ppm [83].
Để dự đốn các dạng anomer có thể tồn tại trong phân đoạn F4, chúng tơi phân tích phổ 1
H-NMR và phổ HSQC, kết quả cho thấy có 02 tín hiệu của α-L- fucose và 01 tín hiệu -D-galactose. Như vậy trong phân đoạn F4 có tồn tại ít nhất 3 loại anomer có độ lặp lại cao tương ứng với 3 tín hiệu trên.
Từ kết quả phân tích thành phần hóa học, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, chúng tơi dự đốn có thể có các dạng anomer sau:
1. Anomer α-L fucose-4-sulfate (hoặc L-fucose-2-sulfate) có liên kết chủ yếu là (1→3) và một phần liên kết (1→2)/( (1→4)
2. Anomer α-L fucose-4-sulfate (hoặc L-fucose-2-sulfate) có liên kết mạch chính (1→3) có liên kết mạch nhánh (1→2)/(1→4)
3. Anomer -D galactose-4-sulfate có liên kết (1→3) hoặc (1→2/(1→4) Theo các tài liệu [83] nếu fucose có liên kết glycoside (1→2) khơng có nhóm thế và có nhóm thế sulfate thì tín hiệu H1 dao động trong vùng 5,0 ppm và
Beagle`re Tissot [84] cho rằng Fucoidan có nhóm thế sulfate ở vị trí số 4 ít khi có liên kết glycoside (1→2) vì khơng thuận lợi về mặt năng lượng và cấu hình. Mặt khác trên phổ 1H-NMR khơng xuất hiện tín hiệu 5,0 ppm. Chính vì lý do nêu trên chúng tơi cho rằng Fucoidan này khơng có khả năng liên kết (1→2) trong mạch chính mà chủ yếu là liên kết (1→3) trong mạch chính.
Để xác nhận sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí C2 và C4 trong 2 vòng
galactopyranose và fucogalactose cũng như sự tồn tại, chúng tơi tiến hành phân tích phổ khối (MS) của phân đoạn F4.
*Phổ Khối (MS).
Phổ ESI-MS của F4 được đưa ra trên hình 3.11 và một số mảnh đặc trưng được đưa ra trên bảng 3.9. Pic cơ sở tại m/z 243,07 là của monosulfate fucose
[FucSO3]-. Tín hiệu tại m/z 225,03 đươc gán cho [FucSO3-H2O]-. Tín hiệu tại
Hình 3.11. Phổ ESI-MS của phân đoạn F4
Bảng 3.9.Một số mảnh đặc trưng trên phổ ESI-MS của Fucoidan.
m/Z ion 243,07 [FucSO3]- 225,03 [FucSO3-H2O]- 389,09 [Fuc2SO3]- 405 [FucGalSO3]− 507 [FucGal(SO3)2]−
galactopyranose cũng như vị trí liên kết của các gốc đường, chúng tơi tiếp tục thực hiện phép phân tích phổ khối 2 lần một số ion cơ sở sau:
-Mảnh m/z 243,07 của ion [FucSO3]- để xác nhận vị trí nhóm sulfate tại gốc đường fucopyranose. Phổ ESI-MS/MS của ion tại m/z 243 đưa ra trên hình 3.12.
- Mảnh m/z 389,09 của ion [Fuc2SO3]- để xác định liên kết fucose-fucose. Phổ ESI-MS/MS của ion tại m/z 389,09 đưa ra trên hình 3.13.
- Mảnh m/z 405 của ion [FucGalSO3]− để xác định vị trí nhóm sulfate tại gốc đường galactopyranose và xác định liên kết fucose-galactose. Phổ ESI- MS/MS của ion tại m/z 389,09 đưa ra trên hình 3.14.
Bérangère Tissot và cộng sự [58,72,84] đã nghiên cứu ảnh hưởng của vị trí nhóm sulfate lên phổ MS, các tín hiệu tại m/z 183,02 chỉ ra sự có mặt của
nhóm sulfate ở vị trí C4 và tín hiệu tại m/z 138,86 là do nhóm sulfate tại vị trí
C2 của α-L-Fucose. Trên phổ ESI-MS/MS (hình 3.11), thấy xuất hiện các tín
hiệu 183,03 và tín hiệu 138,86 do sự cắt mạch 0,2A và 0,2X (hình 3.11), theo [58,72] thì đây là 02 tín hiệu thuộc về sulfate tại vị trí C2 và C4 trong gốc fucose. Tín hiệu tại 138,86 có cường độ lớn chứng tỏ gốc đường fucose bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C2. Như vậy, phổ ESI-MS/MS của ion tại m/z 243,0 xác nhận vị trí nhóm sulfate là C2 và C4 trong vịng fucopyranose.
Hình 3.12. Phổ ESIMS/MS của ion [FucSO3]-, m/z 243
Phổ ESI-MS/MS của mảnh tại m/z 389,09 được đưa ra trên hình 3.13.
Mảnh 243 hình thành do sự cắt liên kết glycoside (dạng Y) có cường độ mạnh. Hai mảnh khác cũng có cường độ mạnh tại m/z 139 (0,2X), 225 (B1) và 1 mảnh cường độ yếu tại m/z 183 (0,2A). Các kết quả này chứng tỏ rằng phân đoạn F4 đang nghiên cứu bị sulfate hóa tại vị trí C2 và C4 của fucose. Ngoài ra trên phổ
cịn có các mảnh tại m/z 371 là do mảnh 389 bị loại nước. Các tín hiệu tại 285
và 315 là do sự cắt mạch 0,2X1 and 0,3X1 (Hình 3.15), chứng tỏ sự có mặt của
α(1→3)- L-fucose. Mặt khác trên phổ không thấy sự tồn tại của các mảnh dạng
0,2A (m/z 204, 329, 431), là các mảnh biểu hiện cho sự có mặt của (1→4)-α-L- fucose, các mảnh này đặc trưng cho Fucoidan tách ra từ rong nâu Ascophyllum nodosum và Fucus evanescens [18,19,22]. Như vậy phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]- xác nhận liên kết giữa 2 gốc fucose là liên kết α(1→3)- L-fucose và
Hình 3.13. Phổ ESIMS/MS của ion [Fuc2SO3]-, m/z 389
Phổ ESI-MS/MS của ion [FucGluSO3]- tại m/z 405 (Hình 3.14) là rất phức tạp. Các tín hiệu mạnh nhất là sự cắt mạch Y1 tại m/z 243 và 259 từ phân cắt của fucose monosulfate và glucose. Ion dạng B1 tại m/z 225 là do sự mất nước của
monosulfate α-L-Fucp và tại m/z 241 từ sự mất nước của monosulfate galactose, cả 2 tín hiệu này đều có cường độ khá mạnh. Liên quan đến các nghiên cứu về liên kết glycoside, một nghiên cứu trước đây của các phân mảnh của disaccharide của heparin [72] cho thấy cơ chế hình thành các ion 0,2A2 yêu cầu hydro tự do ở nhóm hydroxyl C3, để hỗ trợ việc cắt mạch tại liên kết C2-C3. Bên cạnh đó ion 0,2A2 tại m/z 345 và 0,2X0 ion có cường độ lớn có thể là bằng chứng của liên kết (1-4). Các ion dạng 0,2A1 và 3,5A1 tại m/z 199 và 153, có thể là do
sulfate tại vị trí số 4 của galactose. Như vậy, trên phổ ESIMS/MS của ion [FucGalSO3]−, xác nhận liên kết giữa 2 gốc đường fucose và galactose là liên kết (1→4) và nhóm sulfate tại vị trí C4 trong vịng galactopyranose.
0,2A1, m/z 183 0,3A1, m/z 153 O OH OH OH O C H3 OH OSO3- C1, m/z 243 B1, m/z 225 O OH OH O OH OH O CH3 C H3 OSO3- OH Y1, m/z 243 Z1, m/z 225 0,2X1, m/z 285
Hình 3.15. Sự phân mảnh của Fucoidan từ rong nâu Sargassum microcystum dựa vào phổ ESI-MS/MS.
Theo kết quả phân tích thành phần hóa học, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân và phổ khối xác nhận sự có mặt 03 anomer là:
1. Anomer α-L fucose-4-sulfate (hoặc L-fucose-2-sulfate) có liên kết chủ yếu là (1→3)
Tất cả các kết quả trên chỉ ra rằng phân đoạn Fucoidan F4 chiết tách từ rong nâu Sargassum microcystum có cấu trúc gồm mạch chính chủ yếu là α(1→3)-L- fucopyranose và một phần nhỏ là-(1→4)-D galactose, mạch nhánh là α-L- fucopyranosyl-(1→4) và/hoặc β-D-galactopyranosyl-(1→4), nhóm sulfate thế tại vị trí C2, C4 của đường fucose và C4 của gốc đường galactose. Cấu trúc được đưa ra trong hình 3.16.
3)-L-Fucp-(1 3)-L-Fucp-(1 3)--L-Fucp-(1 4
R
R = α-l-fucopyranosyl-(1→4) và/hoặc β-D-galactopyranosyl-(1→4) Nhóm sulfate gắn vào vị trí C2 và C4 của fucose và galactose
CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
4.1. KẾT LUẬN
Qua thời gian nghiên chúng tôi đã được được một số kết quả như sau:
1. Fucoidan đã được phân lập và tách phân đoạn từ loài rong nâu Sargassum
microcystum thu hoạch ở vịnh Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. Hàm lượng Fucoidan
thu nhận được theo phương pháp chiết với dung môi axit nhẹ (pH = 2) là 1,8%. Kết quả tách phân đoạn bằng k thuật sắc ký trao đổi ion cho ra 05 phân đoạn Fucoidan theo gradient tăng dần nồng độ của dung môi rửa giải NaCl (0-2N) lần lượt là F1 (NaCl 0,3N), F2 (NaCl 0,5N), F3 (NaCl 0,8N), F4 (NaCl 1,0N) và F5 (NaCl 1,5N). Trong đó, các phân đoạn chiếm hàm lượng lớn nhất là F3 (15,63%), F4 (10,94%) và F5 (9,16%).
2. Thành phần monosaccharide chính của Fucoidan tổng là fucose (36,10%) và galactose (22,04%), glucose (40,8%), bên cạnh đó cịn có một lượng nhỏ không đáng kể arabinose (0,6%). Hàm lượng carbohydrate, sulfate và uronic axit lần lượt là 24,40%, 25,54%; 10,98%. Kết quả phân tích thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan đại diện F3, F4, F5 so với Fucoidan tổng cho thấy tỉ lệ giữa gốc đường fucose tăng lên so với các gốc đường còn lại, hàm lượng sulfate cũng có sự tăng lên tuy nhiên tại 2 phân đoạn F3 và F5 hàm lượng uronic axit vẫn còn chiếm tỉ lệ lớn tương ứng là 14,86% và 14,8%.
3. Một số đặc trưng cấu trúc của phân đoạn Fucoidan đại diện F4 đã được xác định, phân đoạn Fucoidan F4 này thuộc nhóm galactofucan sulfate, Tất cả các kết quả trong phạm vi nghiên cứu của luận văn chỉ ra rằng phân đoạn Fucoidan F4 chiết tách từ rong nâu Sargassum microcystum có cấu trúc gồm mạch chính chủ yếu là liên kết α(1→3)-L-fucopyranose và một phần nhỏ là-(1→4)-D galactose, mạch nhánh là α-L-fucopyranosyl-(1→4) và/hoặc β-D-galactopyranosyl-(1→4), nhóm sulfate thế chủ yếu ở C2 và 1 phần ở C4 của gốc đường fucose và nhóm thế sulfate tại vị trí C4 của gốc đường galactose.
4.2. KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục nghiên cứu phân tích chi tiết cấu trúc hóa học và hoạt tính sinh học của Fucoidan từ rong S.microcystum và từ các loài rong nâu khác của Việt
Nam nhằm tìm kiếm các hợp chất mới có hoạt tính kháng ung thư và các hoạt tính sinh học khác từ đó làm cơ sở cho việc khai thác và sử dụng hiệu quả nguồn tài nguyên rong nâu của Việt Nam.
2. Nghiên cứu chuyển hóa Fucoidan bằng con đường xúc tác sinh học (chuyển hóa bằng enzyme) để tạo ra các sản phẩm oligo-Fucoidan mới có hoạt tính sinh học đặc hiệu hơn và mạnh hơn sử dụng cho mục đích làm thuốc hoặc thực phẩm chức năng.
1. Nguyễn Hữu Dinh và Huỳnh Quang Năng, 2001, Năm loài mới thuộc chi rong Mơ - Sargassum ở ven biển Việt Nam. ạp ch Sinh học, 23 (1), tr. 1- 10.
2. Nguyễn Hữu Đại và Phạm Hữu Trí, 2003, Một số loài rong biển mới bổ sung cho Việt Nam - Phần II, u ển tập Nghiên cứu biển, 13, tr. 95-114. 3. Nguyễn Hữu Đại và Phạm Hữu Trí , 2002, Một số loài rong biển mới bổ
sung cho khu hệ rong biển Việt Nam - Phần I, u ển tập Nghiên cứu biển,
12, tr. 149-158 .
4. Phạm Hoàng Hộ, 1969, Rong biển Việt Nam - Phần III. Phaeophyceae,
NXB rung tâm học liệu Sài Gòn.
5. Nguyễn Hữu Đại, 1997, Rong Mơ (Sargassaceae) Việt Nam: Nguồn lợi và sử dụng, NXB N ng nghiệp P ồ Ch Minh, tr. 198.
6. Kylin, H, 1913, Zur biochemie der Meersalgen, Z. Physiol, Chem, 83, pp.
171 -197.
7. Usov. A. I, Bilan. M. I, 2009, Fucoidans-sulfated polysaccharides of brown algae, Russian Chemical Reviews, 78 (8), pp. 785-799.
8. Park, Y.H., Jang D.S. and Kim S.B, 1997a, Utilization of marine products (2nd edition); Chapter 4, Seaweed composition, Hyoungsul press, pp. 283-
336.
9. Micheline, R.S.; Cybelle, M.; Celina, G.D.; Fernando, F.S.; Hugo, O.R.;Edda, L, 2007, Antioxidant activities of sulfated polysaccharides from brown and red seaweeds, J. Appl. Phycol. 19, pp.153-160.
10. Wijesinghea W.A.J.P., Jeon Y. J, 2012, Biological activities and potential indusppial applications of fucose rich sulfated polysaccharides and Fucoidans isolated from brown seaweeds: A review, Carbohydrate Polymers, 88, pp. 13–20.
1993, Rong biển miền Bắc Việt Nam, Nhà XB KHKT, Hà Nội.
12. Trần Đình Toại, Châu Văn Minh, 2004, Tiềm năng rong biển Việt Nam,
NXBKHKT, Hà Nội.
13. Percival, E. and McDowell, R.H, 1967, Chemistry and enzymology of marine algal polysaccharides, Academic Press, London and NEW YORK, pp. 6-28 & 73-96 &157-174.
14. Percival, E.G.V. and Ross, A.G, 1950, Fucoidin Part I: The isolation and purification of fucoidin from brown seaweeds. Journal of the Chemical Society, pp. 717-720.
15. Nishino, T., Aizu, Y., & Nagumo, T, 1991, The influence of sulfate content and molecular weight of a fucan sulfate from the brown seaweed Ecklonia kurome on its antithrombin activity, Thrombosis Research, 64(6), pp. 723- 731.
16. Seng Joe Lim, Wan Mustapha, Wan AidaMohamad, Yusof Maskat Jalifah, Latip Khairiah, Haji Badri, Osman Hassan, Bohari M.Yamin, 2016, Characterisation of Fucoidan extracted from Malaysian Sargassum binderi,
Food Chemistry, 209(15), pp. 267-273.
17. Li, B.; Xu, S.Y, 2007, Structural investigation of oligosaccharides in partial acid hydrolyzed products of Fucoidan isolated from Hizikia fusiforme, Nat. Prod. Res. Dev, 19, pp. 550-553.
18. Daniel, R., Berteau, O., Chevolot, L., Varenne, A., Gareil, P. and Goasdoue, N, 2001, Regioselective desulfateion of sulfated L-fucopyranoside by a new sulfoesterase from the marine mollusk Pecten maximus: Application to the structural study of algal Fucoidan (Ascophyllum nodosum), European Journal of Biochemistry, 268, pp. 5617-5626.
19. Daniel, R.; Chevolot L.; Carrascal M.; Tissot, B.; Mourão, P.A.S.; Abian, J, 2007, Electrosprayionization mass spectrometry of oligosaccharides derived
826-834.
20. Nagaoka, M., Shibata, H., Kimura-Takagi, I., Hashimoto, S., Kimura, K., Makino, T., Aiyama, R., Ueyama, S., and Yokokura, T, 1999, Structural study of Fucoidan from Cladosiphon okamuranus Tokida, Glycoconj. J. 16
(1), pp. 19-26.
21. Bilan, M.I.; Grachev, A.A.; Ustuzhanina, N.E.; Shashkov, A.S.; Nifantiev, N.E.; Usov, A.I, 2004, A Highly regular fraction of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L, Carbohydrate Research, 339, pp. 511-
517.
22. Bilan, M.I, Grachev A.A., Ustuzhanina N.E, 2002, Structure of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus evanescens C. Ag, Carbohydrate Research, 337, pp. 719-730.
23. Bilan, M.I.; Grachev, A.A.; Shashkov, A.S.; Nifantiev, N.E.; Usov, A.I, 2006, Structure of a Fucoidan from the brown seaweed Fucus serratus L. Carbohydrate Research, 341, pp. 238-245.
24. Li Bo, Fei Lu, Xinjun Wei and Ruixiang Zhao, 2008, Fucoidan: Structure and Bioactivity, Molecules, 13, pp. 1671-1695.
25. Ejaz Hussain, Li-Jun Wang, Bo Jiang, Saba Riaz, Ghazala Yasmeen Buttd and Da-Yong Shia, 2015, Components of brown seaweeds are potential candidate for cancer therapy - a review, RSC Advances, pp. 1-22.
26. Qiu, X.D.; Amarasekara, A.; Doctor, V, 2006, Effect of oversunphation on the chemical and biological properties of Fucoidan, Carbohydrate Polymers, 63, pp. 224-228.
27. Hemmingson, J.A.; Falshaw, R.; Furneaux, R.H.; Thompson, K, 2006, Structure and antiviral activity of the galactofucan sunphates exppacted from Undaria pinnatifida (Phaeophyta), J. Appl. Phycol, 18, pp. 185-193.
pp. 153-162.
29. Silva, T.M.A.; Alves, L.G.; Queiroz, K.C.S.; Santos, M.G.L.; Marques, C.T.; Chavante, S.F.; Rocha, H.A.O.; Leite, E.L, Partial characterization and anticoagulant activity of a heterofucan from the brown seaweed
Padina gymnospora, Braz. J. Med. Biol. Res, 38, pp. 523-533.
30. Dohura, K.; Kuge, T.; Uomoto, M.; Nishizawa, K.; Kawasaki, Y.; Iha, M, 2007, Prophylactic effect of dietary seaweed Fucoidan against enteral prion infection, Antimicrob. Agents Chemother, 51, pp. 2274-2277.
31. Dobashi, K.; Nishino, T.; Fujihara, M, 1989, Isolation and preliminary characterization of fucose-containing sunphated polysaccharides with blood-anticoagulant activity from seaweed Hizikia fusiforme, Carbohydrate Research, 194, pp. 315-320.
32. Nishino, T.; Yokoyama, G.; Dobahi, K, 1989, Isolation, purification and characterization of fucose-containing sunphated polysaccharides from the brown seaweed Ecklonia kurome and their blood-anticoagulant activities, Carbohydrate Research, 186, pp. 119-129.
33. Hemmingson, J.A., Falshaw, R, Furneaux, R.H, Thompson, K, 2006, Structure and antiviral activity of the galactofucan sunphates exppacted from Undaria pinnatifida (Phaeophyta), J. Appl. Phycol, 18, pp. 185-193. 34. Doh-ura, K.; Kuge, T.; Uomoto, M.; Nishizawa, K.; Kawasaki, Y.; Iha, M,
2007, Prophylactic effect of dietary seaweed Fucoidan against enteral prion infection, Antimicrob, Agents Chemother, 51, pp. 2274-2277.
35. Mandal, P.; Mateu, C.G.; Chattopadhyay, K.; Pujol, C.A.; Damonte, E.B.; Ray, B, 2007, Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica, Antivir, Chem. Chemother, 18, pp. 153-162.
116.
37. Shi, Z.Y.; Guo, Y.Z.; Wang, Z, 2000, Pharmacological activity of Fucoidan from Laminaria japonic, J. Shanghai Fish. Univ, 9, pp. 268-271.
38. Aisa, Y.; Miyakawa, Y.; Nakazato, T.; Shibata, H.; Saito, K.; Ikeda, Y.; Kizaki, M, 2004, Fucoidan induces apoptosis of human HS-Sultan cells accompanied by activation of caspase-3 and down-regulation of ERK pathways, Am. J. Hematol. 78, pp. 7-14.
39. Cumashi, A.; Ushakova, N.A.; Preobrazhenskaya, M.E.; D'Incecco, A.; Piccoli, A.; Totani, L.; Tinari, N.; Morozevich, G.E.; Berman, A.E.; Bilan, M.I.; Usov, A.I.; Nadezhda E.; Grachev, A.A.; Sanderson, C.J.; Kelly, M.; Rabinovich, G.A.; Iacobelli, S, 2007, A comparative study of the anti- inflammatory, anticoagulant, antiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different Fucoidans from brown seaweeds, Glycobiology, 17, pp. 541- 552.
40. Haneji, K.; Matsuda, T.; Tomita, M.; Kawakami, H.; Ohshiro, K.; Uchihara, J.; Masuda, M.; Takasu, N.; Tanaka, Y.; Ohta, T.; Mori, N, 2005, Fucoidan exppacted from Cladosiphon okamuranus Tokida induces apoptosis of
human T-Cell leukemia virus type 1-infected T-Cell lines and primary adult T-Cell leukemia cells, Nuppit, Cancer, 52, pp. 189-201.
41. Maruyamaa, H.; Tamauchib, H.; Iizuka, M.; Nakano, T, 2006, The role of NK cells in antitumor activity of dietary Fucoidan from Undaria pinnatifida
Sporophylls (Mekabu), Planta Med, 72, pp. 1415-1417.
42. Wijesinghe, W. A. J. P., & Jeon, Y. J, 2011b, Biological activities and potential cosmeceutical applications of bioactive components from brown