Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR ( phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1
H, 13C) dưới tác dụng của từ trường. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu
Trong phổ 1
H-NMR, độ chuyển dịch hoá học của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử [71].
Phổ 13
C-NMR Phổ 13
C-NMR cho tín hiệu vạch phổ carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13
C-NMR cũng được tính bằng ppm, với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton ( từ 0-240 ppm).
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharides. Trong phương pháp nghiên cứu cấu trúc của polysaccharides thì phổ 1
H và 13C-NMR thường được sử dụng. Trong một số trường hợp phổ 1
H-NMR còn dùng để định lượng các polysaccharides có trong mẫu phân tích.
Phổ NMR được tín hiệu thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TMS, DSS…). Trong phổ proton tất cả độ chuyển dịch hóa học của carbonhydrate bao gồm monosaccharide, oligosaccharide và polysaccharides có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6ppm trong chất chuẩn TMS. Độ chuyển dịch hóa học anomeric proton của mỗi monosaccharide đều được nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình α hay β. Như với α-anomeric proton sẽ xuất hiện tại δ 5-6ppm trong khi đó với β-anomeric proton là tại vùng δ 4- 5ppm. Mặc dù phổ 13
C-NMR thường có tín hiệu yếu hơn nhưng cũng có những lợi thế so với phổ 1
H NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharides bởi vì độ chuyển dịch hóa học trong phổ 13
C-NMR được trải rộng trên thang đo. Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13
C-NMR đã khắc phục được hiện tượng chồng chéo trên phổ 1
H-NMR. Trên phổ 13C-NMR các tín hiệu anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 90-110ppm trong khi đó các tín hiệu của nonamoreic carbon xuất hiện tại vùng δ 60 và 80ppm. Với polysaccharides có nhóm deoxygen như nhóm –CH3 tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao hơn (15-20ppm). Với hai loại anomeric proton, tín hiệu α-anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 100-105ppm. Với polysaccharides có chứa nhóm uronic acid, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại δ 170-
trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ 60- 64ppm), trong khi độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranose và C2,3 trong furanose) sẽ xuất hiện tại vùng 65-85ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển dịch về phía trường yếu 5-10ppm[71].
Các tín hiệu thu được từ phổ NMR của polysaccharides chưa xác định được ngay cấu trúc mà cần so sánh với các giá trị của phổ đặc trưng sau đó để hoàn thiện cấu trúc phổ 2D NMR và một số kĩ thuật khác. Phổ 1
H-NMR có thể được sử dụng để định lượng polysaccharides. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton(1H- NMR) có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (không có mặt các tín hiệu oligonucleotide, protein hay lipid).
Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thông qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4ppm đến 5,8ppm. Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng monomer cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hóa học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1
H-NMR. Nhìn chung kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hóa học.
Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1
H-1H COSY. Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1
H-13C HSQC. Việc phân tích này cũng mang lại thông tin giống với những phân tích khi methyl hóa. Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharides được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính xác cần xác định thu được từ các loại phổ hai chiều như HSQC, HMBC và COSY.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H-NMR và 13C-NMR được ghi trên máy Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hóa sinh
Nam). Mẫu Fucoidan được pha trong D2O với nồng độ 20 μg/mL, đo ở tần số 75.5 MHz tại nhiệt độ 35o
C.