Phạm Đức Thịnh và cộng sự [65] đã chiết tách Fucoidan từ 05 loài rong
S. denticapum, S. polycystum, S. swartzii, S. mcclurei và Turbina ornata và nghiên cứu đặc trưng cấu trúc của các phân đoạn đại diện cho Fucoidan của mỗi loài rong. Tất cả Fucoidan chiết từ 05 loài rong nói trên đều thuộc fucogalactan sulfate với liên kết chủ yếu trong mạch chính là 1-3.
Lần đầu tiên phát hiện ra sự có mặt đồng thời của các gốc →3)-α-L- Fucp và gốc →4)-β-D-Gal liên kết luân phiên trong mạch galactofucan từ
Trong luận án của Hồ Đức Cường [66] Fucoidan chiết tách từ rong nâu
Sargassum henslowianum đã được xác định với thành phần đường chính là fucose và glucose. Cấu trúc hóa học của Fucoidan này có mạch chính tạo thành từ α-(1→3)-L-fucose và bị sulfate hóa chủ yếu ở vị trí C2, C4 và một phần của C3 của fucose. Glucose bị sulfate hóa tại vị trí C4 và liên kết với
mạch chính qua liên kết glycoside (1 - 4). Đã xác định Fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum swartzii có cấu trúc mạch nhánh và cấu trúc không gian của cả phân tử và ở kích thước cỡ nano đều có dạng hình que. Bằng cách sử dụng cùng các phương pháp hiện đại như tán xạ ánh sáng (LS) và tán xạ tia X góc nhỏ (SAXS), cả cấu trúc hóa học và cấu trúc không gian của Fucoidan được nghiên cứu . Hồ Đức Cường và cộng sự đã nghiên cứu hoạt tính sinh học in vivo (lần đầu tiên ở Việt Nam) và in vitro của Fucoidan từ rong nâu Sargassum henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii thể hiện hoạt tính
gây độc tế bào yếu trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm nhưng khơng thể hiện hoạt tính kháng vi sinh vật kiểm định. Fucoidan từ rong nâu Sargassum
henslowianum và rong nâu Sargassum swartzii ở liều 100mg/kgP/ngày đã có
tác dụng làm giảm một số chỉ tiêu sinh hoá mỡ máu, khối lượng mỡ trên mơ hình chuột béo phì.
Đến năm 2017, Bùi Văn Nguyên và cộng sự đã chiết tách, phân lập, xác định các thành phần cấu tạo và khối lượng phân tử trung bình của các Fucoidan từ 06 loài rong nâu của Nha Trang là: S. polycystum (Fsp), S. mcclurei (Fsm), S. oligocystum (Fso), S. denticarpum (Fsd), S. swatzii (Fss),
Bảng 1.5. Hàm lượng, thành phần hóa học và KLPT trung bình của các mẫu Fucoidan phân lập từ 6 loài rong nâu Việt Nam [67].
Tên lồi HS (%) Thành phần đường trung bình (% mol) Gluc A (%) Sulfate (%) MW kDa
Fuc Man Gal Xyl Glc
S. polycystum 2,70 32,4 2,7 36,3 11,1 10,2 6,8 25,7 52 S. mcclurei 2,10 40,0 2,1 33,1 6,2 20,6 5,2 26,5 26 S. oligocystum 1,60 37,6 1,6 37,0 10,7 7,1 6,5 24,9 38 S. denticarpum 2,20 42,1 2,2 38,9 15,9 2,0 5,8 25,2 41 S. swatzii 0,68 37,0 0,68 34,8 15,5 6,5 7,4 23,4 41 T. ornata 2,75 30,3 vết 9,0 vết vết 7,8 25,6 88
Điểm nổi bật nhất và mới nhất cho đến hiện nay trong luận án của tác giả Bùi Văn Nguyên là đã nghiên cứu và mô tả được đặc điểm cấu trúc của Fucoidan từ hai loài rong Sargassum duplicatum và Sargassum binderi.
Các kết quả nghiên cứu phổ IR, NMR (1D và 2D) và ESI-MS/MS chothấy phân đoạn FTD-2,0N từ rong Turbinaria decurrens là một
galactofucan tạo thành từ 2 loại đường (1→3)-α-L-Fuc với nhóm thế sulfate tại vị trí C2 và β -D-galactose mang nhóm sulfate tại vị trí C6. Galactose nối với fucose qua liên kết glucoside 1→4. Mảnh cấu trúc cơ bản của FTD-2,0N được đề xuất như sau:
[→3-α-L-Fucp2(OSO3-)-(1→4)-β-D-Gal6(OSO3-)-1→]n
Hình 1.11. Mảnh cấu trúc cơ bản Fucoidan chiết tách từ rong
Turbinaria decurrens [67].
Ngoài ra, Bùi Văn Nguyên và cộng sự [67] đã tiến hành nghiên cứu hình dáng và kích thước của các mẫu Fucoidan bằng phương pháp tán xạ tia X góc nhỏ. Kết quả phân tích đồ thị Kratky của sự tán xạ tia X góc nhỏ cho thấy các mẫu Fucoidan có hình dáng kiểu que (rod-like) với các mạch nhánh cồng kềnh và mức độ phân nhánh khác nhau. Kết quả tính tốn cho các mơ hình lý thuyết cho thấy các mạch nhánh có khả năng nằm kề nhau và có độ dài tới 5 gốc đường.
Tác giả Bùi Văn Nguyên đã thử nghiệm hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu Fucoidan trên hai dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD. Kết quả cho thấy các mẫu α đều thể hiện hoạt tính. Hai mẫu có hoạt tính cao nhất là Fto (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 3,1 và 1,6 µg/mL) và Fsp (IC50 đối với Hep-G2 và RD là 5,5 và 5,7 µg/mL).
Bảng 1.6. Hoạt tính gây độc tế bào của các mẫu Fucoidan trên các dòng tế bào ung thư gan Hep-G2 và ung thư mô liên kết RD [67].
Mẫu Fucoidan Hep-G2 RD CS% IC50 (µg/mL) CS% IC50 (µg/mL) S. polycystum 29,7 5,5 11,8 5,7 S. mcclurei 39,3 14,2 64,8 > 20 S. oligocystum 35,3 15,8 11,2 11,4 S. denticarpum 37,5 7.3 27.9 15.9 S. swatzii 31,1 5,8 16,5 18,7 T. ornata 21,8 3,1 4,5 1,6
Năm 2017, nhóm tác giả do Bilan đứng đầu và các cộng sự tại các viện nghiên cứu của Việt Nam đã công bố cấu trúc của Fucoidan từ Sargassum aquifolium thu nhận tại vùng biển Việt Nam, bằng phương pháp phân tích methyl hóa kết hợp phổ NMR các tác giả này đã xác định được 03 polysaccharide có cấu trúc khác nhau sau khi khử sulfate deS-2, deS-4, deS-6.
Ngồi ra, nhóm các nhà khoa học này đã sử dụng thêm phương pháp đo phổ NMR, HSQC và chứng minh được rằng Fucoidan thu nhận từ rong
Sargassum aquifolium là một polysaccharide sulfate có cấu trúc vơ cùng phức
tạp. Thành phần mạch chính được bắt đầu với fuco(xylo)glucuronomannan, xylo(fuco)glucuronan và fucogalactan, mức độ phân nhánh cao và bất thường. Trong thành phần cấu trúc có chưa các gốc đường mannose, galactose, fucopyranose, xylose, fucofuranose, glucoronic axit và một số lượng lớn nhóm sulfate đính tại các vị trí khác nhau.
Hình 1.12. Sơ đồ cấu trúc deS-2, deS-4, deS-6 rong Sargassum aquifolium
Kết luận:
Tổng quan cho thấy, Việt Nam mặc dù có nguồn tài nguyên rong nâu vô cùng đa dạng và phong phú [1,2,3,4,5]. Tuy nhiên, các nghiên cứu về Fucoidan từ rong nâu Việt Nam mới chỉ bắt đầu từ hơn một thập kỉ nay và số các công bố về thành phần, cấu trúc của Fucoidan phân lập từ các loài rong nâu Việt Nam vẫn cịn rất hạn chế. Do vậy, tơi chọn đề tài “ Xác định thành
phần hóa học và đặc điểm cấu trúc của Polysaccharide Sulfate được phân lập từ rong nâu Sargassum microcystum ” là cần thiết nhằm đóng góp thêm
các nghiên cứu về Fucoidan từ rong nâu Việt Nam theo hướng phát triển các hoạt chất mới cũng như khả năng ứng dụng hiệu quả của Fucoidan trong lĩnh vực y dược.
CỨU VÀ THỰC NGHIỆM
2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
Thu thập mẫu rong : Mẫu rong nâu Sargassum microcystum được thu
từ tháng 4 đến tháng 6 năm 2020 tại các vùng ven biển tỉnh Khánh Hòa. Các mẫu rong được thu thập bằng phương pháp thủ công và phân loại bởi PGS.TS. Nguyễn Hữu Đại (chuyên gia phân loài rong biển thuộc Viện Hải Dương học Nha Trang). Các mẫu rong dạng tiêu bản ép khô được lưu trữ tại Viện Nghiên cứu và Ứng dụng cơng nghệ Nha Trang.
Hình 2.1. Mẫu rong Sargassum microcystum 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp chiết tách và phân đoạn Fucoidan
2.2.1.1. Ph ơng pháp chiết tách Fucoidan từ rong nâu
Dựa trên cơ sở tham khảo tài liệu đã công bố về các phương pháp chiết tách Fucoidan cho mục đích nghiên cứu cấu trúc, chúng tơi tiến hành phương pháp chiết theo Patent của Nga (Patent WO 2005/014657). Sơ đồ chiết được trình bày trên hình 2.2.
laminaran và polyuronan) được hòa tan trong dung dịch HCl 0,04N, ly tâm tách phần không tan (polyuronan), phần dịch trong được cho chạy qua cột sắc ký DEAE-cellulose. Hợp chất laminaran (hợp chất khơng có nhóm mang điện tích) khơng bị hấp thụ trên cột sẽ được rửa giải đầu tiên bằng dung dịch HCl loãng (0,04N) hoặc nước cất. Tiếp theo các phân đoạn Fucoidan sẽ được rửa giải bằng dung dịch muối NaCl ở các nồng độ khác nhau.
Hình 2.2. Sơ đồ chiết theo bản quyền Nga (Paten WO 2005,014657)
2.2.2. Phương pháp phân tích cấu trúc của Fucoidan
2.2.2.1. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng tổng carboh drate
Phân tích hàm lượng tổng carbohydrate: Hàm lượng đường tổng được xác định bằng phương pháp phenol-axít sulfuric [68].
2.2.2.2. Ph ơng pháp xác ịnh thành phần monosaccharide
axít về các monomer [68].
2.2.2.3. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng sulfate
Hàm lượng sulfate được phân tích bằng phương pháp đo độ đục với BaCl2/gelatine, sử dụng K2SO4 làm chất chuẩn [69].
2.2.2.4. Ph ơng pháp xác ịnh hàm l ợng uronic axit
Hàm lượng uronic axít được xác định sử dụng phương pháp Carbazole, sử dụng D-glucuronic axít làm chất chuẩn [70].
2.2.2.5. Ph ơng pháp phổ hồng ngoại IR
Phương pháp phổ hồng ngoại (IR) ngày nay là phương pháp vật lý được sử dụng rộng rãi trong phân tích cấu trúc nói chung và phân tích các ionic polysaccharides nói riêng. Phương pháp này mang đến những thông tin cấu trúc quan trọng để xác định vị trí nhóm chức trong phân tử polysaccharides như pectin, hemicellulose, cellulose, tinh bột và các dẫn xuất polysaccharide từ rong biển.
Dựa vào vùng phổ hấp thụ đặc trưng của nhóm sulfate trong phổ hồng ngoại mà ta có thể xác định được vị trí liên kết của nhóm sulfate trong các gốc đường ở vị trí axial hay equatorial (phụ lục 8). Với axial ta chỉ có một vị trí là C4, cịn với equatorial có hai vị trí là C2 và C3, do vậy cần phải dựa vào phổ NMR để xác định các vị trí này.
Mẫu Fucoidan được ép viên với KBr theo tỉ lệ 10 mg mẫu/20 mg KBr. Phổ hồng ngoại FT-IR của Fucoidan được ghi trên máy Carl Zeiss IR-75 spectrometer (đo tại Viện Hóa sinh Hữu cơ Thái Bình Dương - Viện Hàn lâm Khoa học Nga - Chi nhánh Viễn Đơng, L.B.Nga), trong vùng số sóng 4000- 400 cm-1.
2.2.2.6. Ph ơng pháp phổ cộng h ởng từ hạt nhân NMR
Nguyên lý chung của phương pháp phổ NMR ( phổ proton và phổ cacbon) là sự cộng hưởng các tần số khác nhau của các hạt nhân từ (1
H, 13C) dưới tác dụng của từ trường. Các tần số cộng hưởng khác nhau này được biểu
Trong phổ 1
H-NMR, độ chuyển dịch hoá học của các proton được xác định trong thang ppm từ 0-14 ppm, tuỳ thuộc vào mức độ lai hoá của nguyên tử cũng như đặc trưng riêng của từng phân tử [71].
Phổ 13
C-NMR Phổ 13
C-NMR cho tín hiệu vạch phổ carbon. Mỗi nguyên tử carbon sẽ cộng hưởng ở một trường khác nhau và cho tín hiệu phổ khác nhau. Thang đo của phổ 13
C-NMR cũng được tính bằng ppm, với dải thang đo rộng hơn so với phổ proton ( từ 0-240 ppm).
Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân là phương pháp hữu hiệu để nghiên cứu cấu trúc của các polysaccharides. Trong phương pháp nghiên cứu cấu trúc của polysaccharides thì phổ 1
H và 13C-NMR thường được sử dụng. Trong một số trường hợp phổ 1
H-NMR còn dùng để định lượng các polysaccharides có trong mẫu phân tích.
Phổ NMR được tín hiệu thể hiện bằng độ chuyển dịch hóa học (δ, ppm) với chất nội chuẩn (TMS, DSS…). Trong phổ proton tất cả độ chuyển dịch hóa học của carbonhydrate bao gồm monosaccharide, oligosaccharide và polysaccharides có độ chuyển dịch hóa học từ 1-6ppm trong chất chuẩn TMS. Độ chuyển dịch hóa học anomeric proton của mỗi monosaccharide đều được nhận biết riêng phụ thuộc vào cấu hình α hay β. Như với α-anomeric proton sẽ xuất hiện tại δ 5-6ppm trong khi đó với β-anomeric proton là tại vùng δ 4- 5ppm. Mặc dù phổ 13
C-NMR thường có tín hiệu yếu hơn nhưng cũng có những lợi thế so với phổ 1
H NMR trong phân tích cấu trúc polysaccharides bởi vì độ chuyển dịch hóa học trong phổ 13
C-NMR được trải rộng trên thang đo. Các tín hiệu trên thang đo trên phổ 13
C-NMR đã khắc phục được hiện tượng chồng chéo trên phổ 1
H-NMR. Trên phổ 13C-NMR các tín hiệu anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 90-110ppm trong khi đó các tín hiệu của nonamoreic carbon xuất hiện tại vùng δ 60 và 80ppm. Với polysaccharides có nhóm deoxygen như nhóm –CH3 tín hiệu xuất hiện tại vùng trường cao
hơn (15-20ppm). Với hai loại anomeric proton, tín hiệu α-anomeric carbon xuất hiện tại vùng δ 100-105ppm. Với polysaccharides có chứa nhóm uronic acid, các tín hiệu của carbon trong nhóm carboxyl sẽ xuất hiện tại δ 170-
trong pyranose và C5 trong furanose sẽ chuyển dịch về vùng cao (δ 60- 64ppm), trong khi độ chuyển dịch hóa học của nguyên tử carbon bậc 2 có chứa nhóm hydroxyl (C2, 3, 4 trong pyranose và C2,3 trong furanose) sẽ xuất
hiện tại vùng 65-85ppm. Với nguyên tử carbon alkoylate (C5 trong pyranose và C4 trong furanose) độ chuyển dịch hóa học sẽ chuyển dịch về phía trường yếu 5-10ppm[71].
Các tín hiệu thu được từ phổ NMR của polysaccharides chưa xác định được ngay cấu trúc mà cần so sánh với các giá trị của phổ đặc trưng sau đó để hồn thiện cấu trúc phổ 2D NMR và một số kĩ thuật khác. Phổ 1
H-NMR có thể được sử dụng để định lượng polysaccharides. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân proton(1H- NMR) có thể khẳng định độ tinh khiết của mẫu (khơng có mặt các tín hiệu oligonucleotide, protein hay lipid).
Phổ cũng có thể cho biết số monosaccharide thực từ số các cộng hưởng proton anomer thơng qua các tín hiệu trong khoảng δ 4,4ppm đến 5,8ppm. Như vậy dựa vào tỷ lệ tích phân tương đối của các cộng hưởng monomer cũng có thể đánh giá tỷ lệ phân tử của các monosaccharide. Về mặt này kết quả phân tích hóa học có thể phù hợp với kết quả phân tích 1
H-NMR. Nhìn chung kết quả phân tích NMR là chính xác hơn so với kết quả phân tích hóa học.
Nhiều nhóm thế có thể được xác định hoặc sự có mặt của chúng được dự đoán dựa vào phổ hai chiều đồng hạt nhân 1
H-1H COSY. Tiếp theo, số lượng chính xác của các monosaccharide có thể được khẳng định chính xác nhờ việc khảo sát vùng anomer của phổ hai chiều dị hạt nhân 1
H-13C HSQC. Việc phân tích này cũng mang lại thơng tin giống với những phân tích khi methyl hóa. Trật tự các đơn phân trong mạch của polysaccharides được xác định chính là chuỗi các liên kết glycoside, thể hiện thông tin cấu trúc chính xác cần xác định thu được từ các loại phổ hai chiều như HSQC, HMBC và COSY.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1
H-NMR và 13C-NMR được ghi trên máy Brucker Advance DPX- 500 NMR spectrometer (Đức) (đo tại Viện Hóa sinh
Nam). Mẫu Fucoidan được pha trong D2O với nồng độ 20 μg/mL, đo ở tần số 75.5 MHz tại nhiệt độ 35o
C.
2.2.2.7. Ph ơng pháp phổ MS
K thuật ESI/MS: Nguyên lý chung của k thuật ESI (hình 2.3): trong k thuật phun mù điện tử, sự ion hóa được thực hiện bằng cách sử dụng điện trường để tạo các giọt tích điện, tiếp theo các ion phân tử sẽ được tạo ra thơng qua sự ion hóa hơi dung mơi từ các giọt đó. Ion hóa phun mù điện là q trình mà các ion được tạo nên từ pha lỏng và phát sinh từ sự co các giọt tích điện. Luồng khí N2 được phun cùng với dung dịch để tạo mù, các giọt ban đầu được hình thành là nhờ vào điện trường, sự giới hạn tốc độ dòng và % nước trong dung dịch,... Luồng khí trơ nóng được thổi vào các giọt tích điện, làm bay hơi dần dung mơi, khi đó diện tích bề mặt của các giọt sẽ bị co lại. Khi tỷ lệ điện tích/thể tích giọt vượt quá giới hạn Rayleigh sẽ dẫn đến sự nổ Coulomb tạo thành các giọt tích điện mới bé hơn và dần dần là ion phân tử [58,64,72].