Fucoidan là polymer tự nhiên có cấu trúc phức tạp mà trong thành phần hóa học của chúng luôn chứa các nhóm điện tích như gốc sulfate, gốc acetyl. Sự có mặt của chúng là một trong những yếu tố quan trọng xác định tính chất hóa lý cũng như sinh học của Fucoidan. Sự phân bố hàm lượng carbonhydrate theo nhóm điện tích (nhóm sulfate, nhóm acetyl) thường được nghiên cứu bằng phương pháp tách phân đoạn trên nhựa trao đổi ion (dạng anion hoặc cation) dùng dung dịch rửa giải là chất điện ly. Kết quả nhận được của quá trình tách phân đoạn này là các phân đoạn rửa giải sẽ chứa các polymer tự nhiên có cấu trúc tương tự nhau về hàm lượng cũng như vị trí sắp xếp của các nhóm điện tích.
Trong luận văn này chúng tôi dùng nhựa trao đổi anion trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2 x 32 cm), rửa giải gradient với dung dịch NaCl từ 0,1M đến 2,0M và thu lấy 5 phân đoạn. Quá trình sắc ký được biểu diễn trên hình 3.2.
5Hình 3.2. Phân đoạn Fucoidan được chiết từ rong S.microcystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose.
Bảng 3.7. Hàm lượng thu nhận các phân đoạn Fucoidan Kí hiệu mẫu Khối lượng mẫu
thu nhận Hàm lượng thu nhận(%) Công thức tính F1 20,5(mg) 4,12 (20,5x100):500 F2 22,4(mg) 4,48 (22,4x100):500 F3 78,15(mg) 15,63 (78,15x100): 500 F4 54,68(mg) 10,94 (54,68x100):500 F5 45,80(mg) 9,16 (45,80x100):500
Kết quả tách phân đoạn Fucoidan từ rong S. microcystum (hình 3.2) ta thấy có 05 phân đoạn F1, F2, F3, F4 và F5 được tách ra với các nồng độ rửa giải khác nhau của muối NaCl lần lượt là 0,3N; 0,5N; 0,8N; 1,0N và 1,5N. Với 05 phân đoạn thu được sau khi tách sắc ký cho thấy khả năng rong nâu S.microcystum sinh tổng hợp nên 5 dạng loại Fucoidan khác nhau. So với kết quả phân đoạn thu được của Fucoidan từ các loài rong khác thuộc chi Sagassum có thể thấy mỗi loài rong khác nhau sẽ tổng hợp lên các loại Fucoidan với nhiều dạng cấu trúc khác nhau. Các phân đoạn Fucoidan được tách ra bằng sắc ký trao đổi anion chủ yếu phụ thuộc vào mật độ nhóm mang điện tích (nhóm sulfate). Điều này có thể được giải thích là do hàm lượng sulfate càng lớn thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE- Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh, vì vậy để giải phóng phân đoạn Fucoidan này cần dung dịch rửa giải có nồng độ muối cao hơn. Chính vì lý do này mà các phân đoạn Fucoidan từ mỗi loài rong khác nhau tùy thuộc vào mật độ nhóm sulfate sẽ được rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl khác nhau.
7 Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F3
8 Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F4
Bảng 3.8 : Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan chiết từ rong Sargassum microcystum. Phân đoạn Hiệu suất (%) SO3Na % Uronic Axit % Thành phần monosaccharide (mM) (tỷ lệ mol)
Fucose Galactose GalN Arabinose Gluco
Fucoidan thô 25,5 10,98 1 0,62 - 0,16 1,13 F1 4,12 13,54 5,04 1 0,78 0,07 0,072 0,76 F2 4,48 19,40 4,28 1 0,63 0,03 - 0,62 F3 15,63 22,80 14,86 1 0,31 - - 0,51 F4 10,94 28,94 5,22 1 0,31 - - - F5 9,16 32,94 14,8 1 0,34 - - -
Kết quả bảng 3.8 cho thấy hiệu suất tách phân đoạn là 44,33% và hiệu suất tách phân đoạn từ F1 đến F5 lần lượt là 4,12%; 4,48%; 15,63%; 10,94% và 9,16%. Cao nhất là phân đoạn F3 và thấp nhất nhất là phân đoạn F1 và F2. Hàm lượng sulfate tăng dần từ phân đoạn F1 đến phân đoạn F5, chúng dao động từ 13,54% - 32,94%. Điều này có thể được giải thích khi hàm lượng gốc sulfate trong các phân đoạn càng cao thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh nên cần rửa giải các phân đoạn sau cần nồng độ rửa giải của muối cao hơn. Tuy nhiên hàm lượng uronic acid thay đổi không theo sự thay đổi của nhóm sulfate là theo sự tăng dần nồng độ chất điện ly của dung dịch rửa giải mà thay đổi không theo quy luật. Hàm lượng uronic cao
trong Fucoidan thô chiết từ rong Sargassum microcystun.
Thành phần đường của Fucoidan và các phân đoạn bao gồm fucose, galactose, glucose, arabinose. Trong đó thành phần chính của Fucoidan thô là fucose, galactose, glucose, arabinose, sulfat với tỷ lệ mol là 1 : 0,62 : 0,16 :0,72 và lượng nhỏ hợp chất N-Acetylgalactosamine. Ngoài thành phần đường Fucoidan còn có 02 thành phần mang điện tích là nhóm sulfate và nhóm acetyl (axit uronic). Fucose có trong thành phần của tất cả các phân đoạn và đặc biệt là sự có mặt đường galactose trong trong tất cả các phân đoạn với hàm lượng biến đổi từ 0,31 đến 0,78 Mmol chứng tỏ rằng Fucoidan chiết từ loài rong Sargassum microcystum
là dạng sulfate galactofucan. Phân đoạn F1, F2 và F3 ngoài 2 thành phần chính chủ yếu là fucose và galactose còn chứa một lượng tương đối lớn glucose và một lượng nhỏ các gốc đường khác như arabinose hoặc N-Acetyl galactosamine trong khi các phân đoạn F4 và F5 chỉ có 02 thành phần đường chính là fucose và galatose. Từ dữ liệu trên có thể cho rằng phân đoạn F4 và F5 có cấu trúc đơn giản hơn các phân đoạn còn lại. Tỷ lệ mol giữa các đường fucose : galactose của các phân đoạn từ F1 đến F5 tương ứng với các giá trị sau : F1 (1:0,78), F3 ((1:0,63), F3 là (1:0,31), F4 (1:0,31) và F5 là (1:0,34). Tỷ lệ này gần giống nhau đối với 03 phân đoạn là F3, F4 và F5, tuy nhiên với phân đoạn F3 còn thêm thêm thành phần đường glucose và có tỷ lệ mol Fucose : galactose : glucose là (1 :0,31 :0,51). Vì vậy cấu trúc của Fucoidan phân đoạn F3 khác với cấu trúc phân đoạn F4 và F5. Không chỉ có tỷ lệ mol fucose : galactose gần như nhau mà hàm lượng sulfate khác nhau không đáng kể, nên có thể phân đoạn F4, F5 có bộ khung cấu trúc và vị trí nhóm sulfate gần như nhau. Sự khác nhau về cấu trúc của 2 phân đoạn trên chỉ là hàm lượng uronic acid khác nhau F4 (5,22 %), F5 (14,8%). Vì vậy, chúng tôi lựa chọn phân đoạn F4 để phân tích sâu hơn các đặc điểm cấu trúc.
Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate bao gồm các thông tin sau: - Thành phần hóa học
- Vị trí nhóm thế
- Vị trí liên kết và kiểu liên kết
Thành phần hóa học chính của phân đoạn F4 (bảng 3.7) gồm 02 loại đường là fucose, galactose, nhóm điện tích sulfate và lượng nhỏ uronic acid theo tỷ lệ mol như sau 1: 0,31: 0,3. Như vậy để đưa ra vị trí nhóm sulfate cũng như kiểu liên kết α hay β và vị trí liên kết của 02 thành phần đường, chúng tôi tiến hành phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối (MS).
* Phổ Hồng ngoại (IR).
Theo các tài liệu đã công bố về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các đặc điểm cấu trúc của Fucoidan như thành phần đường đơn, kiểu liên kết giữa các gốc đường, hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường,... trong đó hàm lượng các gốc sulfate và vị trí của chúng trên các gốc đường là những yếu tố có ảnh hưởng quan trọng nhất lên hoạt tính sinh học của Fucoidan. Sulfate là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định hoạt tính sinh học của Fucoidan, theo các nhà khoa học [45,46,47,48] hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng ung thư của Fucoidan phụ thuộc vào mật độ và vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường. Vì vậy, việc phân tích hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường trong phân tử Fucoidan sẽ giúp ta làm sáng tỏ về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và đặc trưng cấu trúc của chúng. Phổ hồng ngoại IR là một trong những phương pháp đơn giản nhất thường được sử dụng để xác định vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường .
Phổ hồng ngoại là phương pháp phân tích nhanh và thuận tiện để nghiên cứu cấu trúc phân tử thông qua việc sắp xếp các vạch phổ dao động tương ứng với nhóm nguyên tử nhất định trong phân tử. Trong phân tích cấu trúc của polysaccharide, phương pháp phổ IR cho biết các thông tin về vị trí nhóm sulfate
sóng 820-828 cm đặc trưng cho liên kết C-O-S ở vị trí equatorial C2 hoặc/và C3, vùng 840-848 cm-1 đặc trưng cho liện kết C-O-S ở vị trí axial C4, vùng 1240-1272 cm-1 đặc trưng cho dao động hóa trị của S = O, vùng 1610-1625 cm-1 và 1410 cm-1 đặc trưng cho dao động đối xứng và không đối xứng của nhóm cacboxylat[78].
Khi khảo sát phổ IR mẫu Fucoidan thô và phân đoạn F4 chúng tôi nhận thấy tương tự như phổ hồng ngoại của Fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới và ở Việt Nam, phổ hồng ngoại của mẫu Fucoidan thô và các phân đoạn chiết từ rong nâu Sargassum microcystum tại Bãi Trù thuộc vùng biển Nha Trang, Khánh Hòa cũng chứa những tín hiệu hấp thụ ở vùng 1240-1272 cm-1 (vùng dao động đặc trưng của liên kết S = O) và vùng 800-848 cm-1
(vùng dao động của liên kết C - O - S) khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate.
Hình 3.7. Phổ hồng ngoại IR của mẫu Fucoidan thô được chiết tách từ rong
Sargassum microcystum
Trên phổ IR của mẫu Fucoidan thô (hình 3.7) xuất hiện các tín hiệu hấp thụ tại 3418,32 cm-1 là của nhóm O-H, dải hấp thụ rộng tại 1263,55 cm-1 thuộc về các dao động hóa trị S=O của nhóm sulfate (S=O) là đặc trưng cho các sulfate este.
-OH
S=O C=O
C4 C2
và và vân phổ nhỏ tại vùng 805 cm-1 thuộc về sulfate tại vị trí C2 của vòng pyranose [28]. Dải hấp thụ ở 1042,11 cm-1 xác nhận có dao động đối xứng C-O-C hay có sự hiện diện của hemiacetal.
Hình 3.8. Phổ hồng ngoại IR của phân đoạn F4(Sargassum microcystum) Phổ IR của phân đoạn F4 (hình 3.9): Dải hấp thụ tại 3445,05 cm-1 là của nhóm O-H, dải hấp thụ tại 1266,36 cm-1 (S=O) là đặc trưng cho các sulfate este. Dải hấp thụ ở 1635,18 cm−1 xác nhận sự có mặt của các uronic axit [81]. Dải hấp thụ tại 840,71 cm-1 khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí equatorial C4 và vân phổ nhỏ tại vùng 805 cm-1 thuộc về sulfate tại vị trí C2 của vòng pyranose [28]. Dải hấp thụ ở 1098,18 cm−1 xác nhận có dao động đối xứng C-O- C hay có sự hiện diện của hemiacetal.
Qua kết quả phân tích phổ hồng ngoại một lần nữa khẳng định sự có mặt của nhóm sulfate trong phân tử Fucoidan, điều này cũng phù hợp với các kết quả phân tích thành phần monosaccharide ở bảng 3.7. Tuy nhiên phổ IR cũng chỉ cho
-OH C=O S=O S=O C4 C2
thêm những thông tin từ phổ cộng hưởng từ hạt nhân NMR và phổ khối (MS). Kết luận: Phổ Hồng ngoại xác nhận sự có mặt sulfate và vị trí nhóm sulfate tại vị trí C4 và tại vị trí C2 trên gốc đường pyranose (galactose và fucose).
*Phổ Cộng hưởng từ hạt nhân.
Vì Fucoidan là một polymer có cấu trúc phức tạp, để thu được phổ NMR và MS có độ phân giải tốt mẫu Fucoidan được tiến hành thủy phân nhẹ với điều kiện đưa ra trong phần phương pháp nghiên cứu.
Hình 3.9 b. Phổ 13C- NMR của phân đoạn F4. Phổ 1
H-NMR của phân đoạn F4 (Hình 3.9 a) chúng tôi thấy có các tín hiệu sau. Tín hiệu 1,2-1,5 ppm là vùng H6 của fucose với cường độ mạnh, vùng 3,5-4,5 ppm là vùng H của các gốc đường pyranosyl và vùng 5,2-5,5 là vùng H1 của anomer dạng . Điều này cho thấy trong phân đoạn F4 có mặt chủ yếu là -L- fucose. Kết quả này hoàn toàn phù hợp với kết quả phân tích thành phần monosacharide trong mẫu phân đoạn F4.
So sánh phổ 1
H-NMR của fucan sulfat hóa ở C4 thì phổ 1H-NMR của galactofucan sulfat hóa ở C4 còn xuất hiện thêm 02 nhóm tín hiệu 4,5 -4,9 ppm tại vùng H1 của anomer dạng β. Điều này được giải thích bởi sự có mặt của gốc đường galactose trong phân tử galactofucan. Kết quả này chứng tỏ rằng galactose có mặt trong galactose là dạng β-D-galactose.
Như vậy phổ 1
H-NMR xác nhận sự có mặt 02 kiểu liên kết khác nhau đó là
-L-fucose và β-D-galactose.
Phổ 13C-NMR của phân đoạn F4 (Hình 3.9b) có độ phân giải khá tốt. Trên phổ chỉ thấy xuất hiện 03 nhóm tín hiệu như sau : Nhóm tín hiệu rõ ràng nhất ở vùng trường cao tương ứng với độ chuyển dịch hóa học trong vùng 17 ppm,
của C1 anomer và những tín hiệu của cacbon trong vòng hexopyranose từ C2 đến C5. Sự có mặt tín hiệu tại 80ppm chứng tỏ rằng trong phân tử F4 có tồn tại liên kết (1→4)-fucose và/hoặc (1→4)-galactose. Kết quả phân tích thành phần đường cho thấy F4 chỉ có 2 loại đường là fucose và galactose. Tuy nhiên vùng anomeric của cả 2 phổ 1
H và 13C-NMR đều nhiều hơn 2 peak, điều đó chứng tỏ, 2 thành phần này tham gia các liên kết glycoside khác nhau. Để xác nhận các liên kết trong vùng anomer, chúng tôi tiến hành phân tích phổ HSQC của phân đoạn F4. Như vậy trên phổ 13
C-NMR xác nhận sự có mặt của fucose, galactose và có sự tồn tại của liên kết (1→4)-fucose và/hoặc (1→4)-galactose.
* Phổ HSQC
Vùng anomeric có 3 tín hiệu, tín hiệu tại H1/C1 tại 4,54/96,28 ppm được quy cho -D-galactose ; 2 tín hiệu tại 5,22/92,35 ppm và 5,37/99,1 ppm là của α-L- fucose tồn tại ở mạch chính và mạch nhánh của phân tử Fucoidan F4; 2 tín hiệu mạnh tại 16,01/1,20 và 15,3/1,28 ppm ứng với nhóm CH3 của fucose. Trên phổ 1H- NMR trong vùng anomeric có 4 tín hiệu tuy nhiên trên phổ HSQC chỉ xuất hiện 03 tín hiệu thuộc về H1 như vậy tín hiệu còn lại 4,8 ppm thuộc về tín hiệu của proton trong gốc đường. Vùng tín hiệu của proton trong gốc đường (trừ vùng tín hiệu H1) luôn luôn nhỏ hơn 4,6 ppm, vì vậy có thể cho rằng đây là tín hiệu của proton có gắn với nguyên tử C có mang nhóm thế có độ âm điện cao. Theo các công trình [82] đây là vị trí H4 có nhóm thế sulfate. Theo kết quả bảng 3.7 thành phần của Fucoidan và phổ hồng ngoại có thể cho rằng tín hiệu này thuộc về proton H4 của 2 monomer là galactose và fucose. Mặc dù vậy, trên phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu vùng 3,7 là vùng tín hiệu H4 của các gốc đường fucopyranosyl chứng tỏ rằng chỉ một phần nhóm OH ở vị trí số 4 bị thế bởi nhóm sulfate.
Hình 3.10. Phổ HSQC phân đoạn F4 Trên phổ hồng ngoại và phổ 1
hưởng từ hạt nhân H-NMR vùng tín hiệu H6 là 1,2 ppm-1,3 ppm [83].
Để dự đoán các dạng anomer có thể tồn tại trong phân đoạn F4, chúng tôi phân tích phổ 1
H-NMR và phổ HSQC, kết quả cho thấy có 02 tín hiệu của α-L- fucose và 01 tín hiệu -D-galactose. Như vậy trong phân đoạn F4 có tồn tại ít nhất 3 loại anomer có độ lặp lại cao tương ứng với 3 tín hiệu trên.
Từ kết quả phân tích thành phần hóa học, phổ hồng ngoại, phổ cộng hưởng từ hạt nhân, chúng tôi dự đoán có thể có các dạng anomer sau:
1. Anomer α-L fucose-4-sulfate (hoặc L-fucose-2-sulfate) có liên kết chủ yếu là (1→3) và một phần liên kết (1→2)/( (1→4)
2. Anomer α-L fucose-4-sulfate (hoặc L-fucose-2-sulfate) có liên kết mạch chính (1→3) có liên kết mạch nhánh (1→2)/(1→4)
3. Anomer -D galactose-4-sulfate có liên kết (1→3) hoặc (1→2/(1→4) Theo các tài liệu [83] nếu fucose có liên kết glycoside (1→2) không có nhóm thế và có nhóm thế sulfate thì tín hiệu H1 dao động trong vùng 5,0 ppm và Beagle`re Tissot [84] cho rằng Fucoidan có nhóm thế sulfate ở vị trí số 4 ít khi có liên kết glycoside (1→2) vì không thuận lợi về mặt năng lượng và cấu hình. Mặt khác trên phổ 1H-NMR không xuất hiện tín hiệu 5,0 ppm. Chính vì lý do nêu trên chúng tôi cho rằng Fucoidan này không có khả năng liên kết (1→2) trong mạch chính mà chủ yếu là liên kết (1→3) trong mạch chính.
Để xác nhận sự có mặt của nhóm sulfate tại vị trí C2 và C4 trong 2 vòng