CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2.PHÂN TÍCH THÀNH PHẦN HÓA HỌC
3.2.1. Xây dựng đường chuẩn
Chúng tôi phân tích thành phần Fucoidan bao gồm : carbohydrate, sulfate và uronic acid bằng phương pháp truyền thống là xây dựng đường chuẩn và xác định mật độ quang của các chất cần phân tích. Kết quả xây dựng đường chuẩn các chất được dẫn ở phụ lục 1, phụ lục 2 và phụ lục 3.
Phân tích thành phần monosaccharide trong fuocidan bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC), xây dựng đường chuẩn dựa trên diện tích peak tương ứng. Sử dụng điều kiện phân tích mẫu trên hệ thống sắc kí ion ICS – 6000 (Thermoscientific), sử dụng cột phân tích trao đổi anion CarboPac MA1(50mm x 4); đầu dò điện hóa (Electrochemical Detector – ED), pha động NaOH 1M, tốc độ dòng 0,4mL/ phút, thể tích tiêm mẫu 500 µL, thời gian phân tích là 30 phút, chúng tôi thu được sắc lý đồ trên hình 3.1 cho thấy các mẫu chuẩn bao gồm (Fucose, Arabinose, Glucose, Galactose) các peak có đỉnh nhọn hoàn toàn tách biệt nhau.
đường chuẩn để xác định hàm lượng các thành phần monosaccharide theo các phụ lục 4,5,6,7.
3.2.2. Phân tích thành phần hóa học của Fucoidan
Để lựa chọn mẫu Fucoidan cho các nghiên cứu tiếp theo, chúng tôi tiến hành phân tích sơ bộ thành phần hóa học của 02 mẫu Fucoidan chiết từ loài rong
S.microcystum thu tại 02 địa điểm khác nhau.
2Bảng 3.4. Hàm lượng thu nhận và thành phần hóa học Fucoidan từ hai khu vực biển khác nhau
Các kết quả thu nhận
Nơi thu hái rong
Hòn Rùa Bãi Trù - Vinpearland
Hàm lượng carbohydrate tổng(%)(**) 36,06 24,4 Hàmlượng sulfate (%)(**) 19,16 25,54 Hàm lượng uronic axit(%)(**) 9,00 10,98
** Hàm lượng tính theo khối lượng mẫu Fucoidan thô phân tích
Theo kết quả phân tích bảng 3.4 , mẫu Fucoidan thu nhận tại Hòn Rùa có hàm lượng carbohydrate cao hơn gần 1,5 lần so với mẫu rong thu hái tại Bãi Trù. Tuy nhiên hàm lượng sulfate của mẫu rong này lại thấp hơn so với mẫu Fucoidan được chiết tách với mẫu rong thu hái tại Bãi Trù. Sự khác biệt này rất đáng kể. Hàm lượng uronic axit của cả 2 mẫu Fucoidan cũng có sự khác nhau tuy nhiên không đáng kể. Theo các nghiên cứu của các nhà khoa học trước đây cho thấy sulfate và uronic axit là hai trong những yếu tố có ảnh hưởng lớn đến hoạt tính sinh
pháp chiết Fucoidan bằng dung môi axit loãng cũng là phương pháp được lựa chọn trong nhiều nghiên cứu về cấu trúc và hoạt tính sinh học của Fucoidan đã được công bố.
Sau khi lựa chọn được Fucoidan chiết tách từ rong nâu S.microcystum thu hái tại Bãi Trù, chúng tôi tiến hành phân tích thành phần polysaccharide , kết quả dẫn ra trên bảng 3.5.
Các kết quả phân tích trong bảng 3.5 cho thấy hàm lượng carbohydrate, sulfate và uronic axit của mẫu Fucoidan được chiết tách từ rong S.microc stum lần l ợt tương ứng là 24,40 %; 25,54 % và 10,98%.
Kết quả bảng 3.5 cho thấy mẫu Fucoidan thô được thu nhận từ rong nâu
Sargassum microcystum trước khi chạy sắc kí phân đoạn ngoài ba thành phần chính là fucose (36,10%) và galactose (22,40%), glucose (40,80%), còn có thêm các đường đơn khác với hàm lượng rất nhỏ Arabinose (0,6%), không chứa N- Acetyl-galactosamine.
3Bảng 3.5. Thành phần hóa học mẫu Fucoidan chiết từ rong S.microcystum
Kí hiệu mẫu
Thành phần đường đơn của Fucoidan (mol %) Cacbo hydrate % w/w** SO42- % w/w* * Uronic axit % w/w**
Fuc Gal Glu N-Acetyl
galactosamine Arabinose PS- S.micro cystum 36,10 22,04 40,80 nd 0,60 24,40 25,54 10,98
Fucoidan phân lập từ 6 loài cùng chi với S.microcystum rong nâu Việt Nam [67]. Tên loài HS (%) Thành phần đường trung bình (% mol) Gluc A (%) Sulfate (%)
Fuc Man Gal Xyl Glc
S. polycystum 2,70 32,4 2,7 36,3 11,1 10,2 6,8 25,7 S. mcclurei 2,10 40,0 2,1 33,1 6,2 20,6 5,2 26,5 S. oligocystum 1,60 37,6 1,6 37,0 10,7 7,1 6,5 24,9 S. denticarpum 2,20 42,1 2,2 38,9 15,9 2,0 5,8 25,2 S. swatzii 0,68 37,0 0,68 34,8 15,5 6,5 7,4 23,4 S.binderi 1,13 42,2 10,3 38,0 9,5 0
Các kết quả phân tích trong bảng 3.5 và 3.6 cho thấy mẫu Fucoidan thu nhận từ rong Sargassum microcystum do chúng tôi tiến hành khảo sát so với kết quả đã được công bố về Fucoidan của các loài rong trong cùng chi do tác giả Bùi Văn Nguyên, Phạm Đức Thịnh và các cộng sự [65,66,67] thu nhận chúng ta có thể nhận thấy, tỉ lệ giữa các gốc đường giữa các loài rong trong cùng chi khác nhau rất nhiều. Theo nhóm tác giả này, thành phần đường của mẫu Fucoidan được chiết tách từ các loài rong cùng chi Sargassum chứa chủ yếu đường fucose và galactose với tỉ lệ 1:1, gốc đường glucose chiếm 1 tỉ lệ rất nhỏ. Trong khi đó, thành phần đường đơn từ mẫu Fucoidan của loài rong Sargassum microcystum tôi đã thu nhận và nghiên cứu ngoài hai thành phần chính đường Fucose (36,1%) và Galactose (22,4%) giống như các tác giả trước đó đã nghiên cứu với tỉ lệ 3:2 thì điểm khác
7,1%,S. denticarpum với hàm lượng glucose 2%,S. swatzii với hàm lượng glucozo 6,5%, S.binderi kh ng chứa glucose...) . Như vậy, hàm lượng các gốc đường này biến đổi theo từng thời điểm, vị trí địa lí thu rong, trong từng chi rong và từng loài rong khác nhau. Các kết quả này cũng hoàn toàn phù hợp với các công bố trước đó về sự đa dạng của thành phần hóa học của Fucoidan. Kết quả phân tích thành phần đường chỉ ra rằng Fucoidan của các loài rong thuộc các chi rong khác nhau là khác nhau, các loài rong thuộc cùng một chi rong hay trong cùng một loài rong cũng khác nhau về thành phần và tỉ lệ mol giữa các gốc đường đơn. Những đặc điểm này tạo ra sự đa dạng cấu trúc cũng như hoạt tính sinh học của Fucoidan, nhưng đồng thời cũng làm cho việc phân tích chi tiết cấu trúc của Fucoidan trở nên vô cùng phức tạp. Đó chính là lý do tại sao cho đến nay trên thế giới mới chỉ có một vài công bố về cấu trúc hoàn chỉnh của Fucoidan, nhưng không một công bố nào đưa ra được mối liên hệ có tính quy luật cho cấu trúc Fucoidan với các bộ rong.
Sự khác nhau này có thể được giải thích do sự khác nhau về vị trí và thời gian thu mẫu. Điều này cho thấy thành phần cũng như đặc điểm cấu trúc của Fucoidan vô cùng phức tạp.
Theo các công bố [63,64,65,66,67] thì các Fucoidan của các loài rong tại các vùng biển Việt Nam đều có một đặc điểm chung là bên cạnh hàm lượng sulfate cao, hai gốc đường fucose và galactose luôn chiếm hàm lượng lớn hơn so với các gốc đường khác, với đặc điểm này chúng được gọi là các galactofucan sulfate hóa.
So với Fucoidan chiết từ các loài rong nâu khác trên thế giới như Nga, Nhật Bản, Hàn Quốc,... thì Fucoidan chiết từ rong nâu Việt Nam có sự khác biệt lớn về thành phần các đường đơn. Đó là hàm lượng fucose thấp hơn. Fucoidan phân lập từ một số loài rong nâu của vùng Viễn Đông, L.B.Nga có hàm lượng fucose cao hơn rất nhiều như Fucoidan chiết tách từ rong Fucus evanescens, Laminaria japonica
và Laminaria cichorioides có hàm lượng fucose (tính theo carbohydrate) lần lượt là 88%, 86% và 100% [37,53], hay Fucoidan chiết từ rong Hizikia fusiformis
(Nhật Bản) hàm lượng fucose chiếm 80%, Fucoidan của từ rong Sargassum stenophyllum (Brazil) hàm lượng fucose chiếm 67,8%, hiện nay loại Fucoidan duy
Fucus vesiculosus có hàm lượng fucose chiếm 100%. Điều này cho thấy sự đa dạng về thành phần hóa học của Fucoidan trong các loài rong khác nhau, thậm chí là trong cùng một chi rong Sargassum của Việt Nam và của Brazil cũng có thành phần rất khác nhau. Nhìn chung Fucoidan của rong nâu sinh trưởng ở vùng biển ôn đới thường có thành phần đường tương đối đơn giản, chúng hầu như chỉ có một gốc đường fucose và một lượng rất nhỏ các đường đơn khác. Trong khi đó Fucoidan của rong nâu ở biển nhiệt đới nói chung và biển Việt Nam nói riêng phần lớn thuộc nhóm galactofucan, trong thành phần chủ yếu chứa hai gốc đường fucose và galactose cùng với một lượng nhỏ các gốc đường khác như rhamnose, xylose, mannose, glucose. Sự khác nhau về thành phần và hàm lượng các đường đơn của Fucoidan từ các loài rong khác nhau một lần nữa khẳng định rằng điều kiện môi trường có ảnh hưởng rất lớn đến quá trình sinh tổng hợp polysaccharide của rong nâu.
3.2.3. Tách phân đoạn và thành phần hóa học các phân đoạn Fucoidan
Fucoidan là polymer tự nhiên có cấu trúc phức tạp mà trong thành phần hóa học của chúng luôn chứa các nhóm điện tích như gốc sulfate, gốc acetyl. Sự có mặt của chúng là một trong những yếu tố quan trọng xác định tính chất hóa lý cũng như sinh học của Fucoidan. Sự phân bố hàm lượng carbonhydrate theo nhóm điện tích (nhóm sulfate, nhóm acetyl) thường được nghiên cứu bằng phương pháp tách phân đoạn trên nhựa trao đổi ion (dạng anion hoặc cation) dùng dung dịch rửa giải là chất điện ly. Kết quả nhận được của quá trình tách phân đoạn này là các phân đoạn rửa giải sẽ chứa các polymer tự nhiên có cấu trúc tương tự nhau về hàm lượng cũng như vị trí sắp xếp của các nhóm điện tích.
Trong luận văn này chúng tôi dùng nhựa trao đổi anion trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose (3,2 x 32 cm), rửa giải gradient với dung dịch NaCl từ 0,1M đến 2,0M và thu lấy 5 phân đoạn. Quá trình sắc ký được biểu diễn trên hình 3.2.
5Hình 3.2. Phân đoạn Fucoidan được chiết từ rong S.microcystum bằng sắc ký trao đổi anion trên cột DEAE-cellulose.
Bảng 3.7. Hàm lượng thu nhận các phân đoạn Fucoidan Kí hiệu mẫu Khối lượng mẫu
thu nhận Hàm lượng thu nhận(%) Công thức tính F1 20,5(mg) 4,12 (20,5x100):500 F2 22,4(mg) 4,48 (22,4x100):500 F3 78,15(mg) 15,63 (78,15x100): 500 F4 54,68(mg) 10,94 (54,68x100):500 F5 45,80(mg) 9,16 (45,80x100):500
Kết quả tách phân đoạn Fucoidan từ rong S. microcystum (hình 3.2) ta thấy có 05 phân đoạn F1, F2, F3, F4 và F5 được tách ra với các nồng độ rửa giải khác nhau của muối NaCl lần lượt là 0,3N; 0,5N; 0,8N; 1,0N và 1,5N. Với 05 phân đoạn thu được sau khi tách sắc ký cho thấy khả năng rong nâu S.microcystum sinh tổng hợp nên 5 dạng loại Fucoidan khác nhau. So với kết quả phân đoạn thu được của Fucoidan từ các loài rong khác thuộc chi Sagassum có thể thấy mỗi loài rong khác nhau sẽ tổng hợp lên các loại Fucoidan với nhiều dạng cấu trúc khác nhau. Các phân đoạn Fucoidan được tách ra bằng sắc ký trao đổi anion chủ yếu phụ thuộc vào mật độ nhóm mang điện tích (nhóm sulfate). Điều này có thể được giải thích là do hàm lượng sulfate càng lớn thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE- Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh, vì vậy để giải phóng phân đoạn Fucoidan này cần dung dịch rửa giải có nồng độ muối cao hơn. Chính vì lý do này mà các phân đoạn Fucoidan từ mỗi loài rong khác nhau tùy thuộc vào mật độ nhóm sulfate sẽ được rửa giải ra ở các nồng độ muối NaCl khác nhau.
7 Hình 3.4. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F3
8 Hình 3.5. Sắc ký đồ HPLC xác định thành phần đường đơn phân đoạn F4
Bảng 3.8 : Thành phần hóa học của các phân đoạn Fucoidan chiết từ rong Sargassum microcystum. Phân đoạn Hiệu suất (%) SO3Na % Uronic Axit % Thành phần monosaccharide (mM) (tỷ lệ mol)
Fucose Galactose GalN Arabinose Gluco
Fucoidan thô 25,5 10,98 1 0,62 - 0,16 1,13 F1 4,12 13,54 5,04 1 0,78 0,07 0,072 0,76 F2 4,48 19,40 4,28 1 0,63 0,03 - 0,62 F3 15,63 22,80 14,86 1 0,31 - - 0,51 F4 10,94 28,94 5,22 1 0,31 - - - F5 9,16 32,94 14,8 1 0,34 - - -
Kết quả bảng 3.8 cho thấy hiệu suất tách phân đoạn là 44,33% và hiệu suất tách phân đoạn từ F1 đến F5 lần lượt là 4,12%; 4,48%; 15,63%; 10,94% và 9,16%. Cao nhất là phân đoạn F3 và thấp nhất nhất là phân đoạn F1 và F2. Hàm lượng sulfate tăng dần từ phân đoạn F1 đến phân đoạn F5, chúng dao động từ 13,54% - 32,94%. Điều này có thể được giải thích khi hàm lượng gốc sulfate trong các phân đoạn càng cao thì khả năng liên kết với nhựa trao đổi anion DEAE-Cellulose (Diethylaminoethyl-cellulose) càng mạnh nên cần rửa giải các phân đoạn sau cần nồng độ rửa giải của muối cao hơn. Tuy nhiên hàm lượng uronic acid thay đổi không theo sự thay đổi của nhóm sulfate là theo sự tăng dần nồng độ chất điện ly của dung dịch rửa giải mà thay đổi không theo quy luật. Hàm lượng uronic cao
trong Fucoidan thô chiết từ rong Sargassum microcystun.
Thành phần đường của Fucoidan và các phân đoạn bao gồm fucose, galactose, glucose, arabinose. Trong đó thành phần chính của Fucoidan thô là fucose, galactose, glucose, arabinose, sulfat với tỷ lệ mol là 1 : 0,62 : 0,16 :0,72 và lượng nhỏ hợp chất N-Acetylgalactosamine. Ngoài thành phần đường Fucoidan còn có 02 thành phần mang điện tích là nhóm sulfate và nhóm acetyl (axit uronic). Fucose có trong thành phần của tất cả các phân đoạn và đặc biệt là sự có mặt đường galactose trong trong tất cả các phân đoạn với hàm lượng biến đổi từ 0,31 đến 0,78 Mmol chứng tỏ rằng Fucoidan chiết từ loài rong Sargassum microcystum
là dạng sulfate galactofucan. Phân đoạn F1, F2 và F3 ngoài 2 thành phần chính chủ yếu là fucose và galactose còn chứa một lượng tương đối lớn glucose và một lượng nhỏ các gốc đường khác như arabinose hoặc N-Acetyl galactosamine trong khi các phân đoạn F4 và F5 chỉ có 02 thành phần đường chính là fucose và galatose. Từ dữ liệu trên có thể cho rằng phân đoạn F4 và F5 có cấu trúc đơn giản hơn các phân đoạn còn lại. Tỷ lệ mol giữa các đường fucose : galactose của các phân đoạn từ F1 đến F5 tương ứng với các giá trị sau : F1 (1:0,78), F3 ((1:0,63), F3 là (1:0,31), F4 (1:0,31) và F5 là (1:0,34). Tỷ lệ này gần giống nhau đối với 03 phân đoạn là F3, F4 và F5, tuy nhiên với phân đoạn F3 còn thêm thêm thành phần đường glucose và có tỷ lệ mol Fucose : galactose : glucose là (1 :0,31 :0,51). Vì vậy cấu trúc của Fucoidan phân đoạn F3 khác với cấu trúc phân đoạn F4 và F5. Không chỉ có tỷ lệ mol fucose : galactose gần như nhau mà hàm lượng sulfate khác nhau không đáng kể, nên có thể phân đoạn F4, F5 có bộ khung cấu trúc và vị trí nhóm sulfate gần như nhau. Sự khác nhau về cấu trúc của 2 phân đoạn trên chỉ là hàm lượng uronic acid khác nhau F4 (5,22 %), F5 (14,8%). Vì vậy, chúng tôi lựa chọn phân đoạn F4 để phân tích sâu hơn các đặc điểm cấu trúc.
Đặc điểm cấu trúc của polysaccharide sulfate bao gồm các thông tin sau: - Thành phần hóa học
- Vị trí nhóm thế
- Vị trí liên kết và kiểu liên kết
Thành phần hóa học chính của phân đoạn F4 (bảng 3.7) gồm 02 loại đường là fucose, galactose, nhóm điện tích sulfate và lượng nhỏ uronic acid theo tỷ lệ mol như sau 1: 0,31: 0,3. Như vậy để đưa ra vị trí nhóm sulfate cũng như kiểu liên kết α hay β và vị trí liên kết của 02 thành phần đường, chúng tôi tiến hành phân tích phổ hồng ngoại (IR), phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR) và phổ khối (MS).
* Phổ Hồng ngoại (IR).
Theo các tài liệu đã công bố về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và các đặc điểm cấu trúc của Fucoidan như thành phần đường đơn, kiểu liên kết giữa các gốc đường, hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường,... trong đó hàm lượng các gốc sulfate và vị trí của chúng trên các gốc đường là những yếu tố có ảnh hưởng quan trọng nhất lên hoạt tính sinh học của Fucoidan. Sulfate là một trong những yếu tố quan trọng nhất quyết định hoạt tính sinh học của Fucoidan, theo các nhà khoa học [45,46,47,48] hoạt tính kháng đông tụ máu và kháng ung thư của Fucoidan phụ thuộc vào mật độ và vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường. Vì vậy, việc phân tích hàm lượng và vị trí nhóm sulfate trên các gốc đường trong phân tử Fucoidan sẽ giúp ta làm sáng tỏ về mối quan hệ giữa hoạt tính sinh học và đặc trưng cấu trúc của chúng. Phổ hồng ngoại IR là một trong những phương pháp đơn giản nhất thường được sử dụng để xác định vị trí của nhóm sulfate trên các gốc đường .
Phổ hồng ngoại là phương pháp phân tích nhanh và thuận tiện để nghiên cứu cấu trúc phân tử thông qua việc sắp xếp các vạch phổ dao động tương ứng với