CHƢƠNG 2 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.4. Xác định hoạt tính apoptosis của cao chiết trên mơ hình tế bào ung
bào ung thƣ vú
A. Kiểm tra độc tế bào
Kiểm tra độc tế bào của cao chiết Ngải trắng trên dòng tế bào MCF-7. Phƣơng pháp giải đông và nuôi cấy tăng sinh tế bào
Các dòng tế bào đƣợc cung cấp bởi ATCC hay công ty CLS trong các ống đông lạnh (cryovial). Các ống tế bào đông lạnh đƣợc giải đông nhanh ở 37oC trong bể ổn nhiệt từ 2-3 phút dựa trên phƣơng pháp “đông lạnh chậm,
giải đông nhanh”. Huyền phù tế bào đƣợc chuyển vào ống ly tâm (15 ml) có bổ sung môi trƣờng nuôi cấy phù hợp với 10% FBS và 0,5% kháng sinh Pen/Strep, sau đó ly tâm 1500 v/p, loại bỏ dịch nổi và thu lại cặn tế bào ở đáy ống ly tâm. Các tế bào đƣợc huyền phù vào môi trƣờng ni cấy phù hợp. Dịng tế bào MCF-7 đƣợc nuôi cấy trong mơi trƣờng DMEM/F12. Tồn bộ dung dịch tế bào huyền phù đƣợc chuyển vào đĩa nuôi cấy tế bào 100 mm và nuôi cấy ở 37oC và 5% CO2. Sau 12-24 giờ, môi trƣờng cũ đƣợc loại bỏ và môi trƣờng nuôi cấy phục hồi mới với 20% FBS đƣợc thay thế. Tế bào tiếp tục đƣợc nuôi cấy phục hồi từ 4-7 ngày trƣớc khi chuyển sang giai đoạn tăng sinh. Tế bào đƣợc nuôi cấy tăng sinh với môi trƣờng tăng sinh phù hợp, bổ sung 10% FBS và 0,5% kháng sinh Pen/Strep. Môi trƣờng nuôi cấy tế bào đƣợc thay từ 2-3 lần/tuần. Khi tế bào đạt 80% diện tích bề mặt ni cấy, tế bào đƣợc cấy chuyển bằng Trypsin/EDTA 0,25% theo tỉ lệ 1:3. Sau đó, tế bào tiếp tục đƣợc nuôi cấy tăng sinh và thu nhận khi đạt đƣợc lƣợng tế bào cần thiết.
Phƣơng pháp đánh giá mức độ tăng sinh của tế bào
Để đánh giá sự tăng sinh tế bào, nghiên cứu sử dụng bộ kit WST-1 (Roche). Nguyên tắc hoạt động của bộ kit dựa trên phản ứng phân cắt hợp chất WST-1 tetrazolium bởi enzyme dehydrogenases có trong ty thể tế bào. Dehydrogenases là một enzyme trong chu i hô hấp tế bào, chuyển hóa WST- 1 tetrazolium thành formazan có màu vàng và hấp thu bƣớc sóng 450 nm. Tế bào càng phát triển nhanh thì q trình hơ hấp và chuyển hóa của tế bào xảy ra mạnh, dẫn đến sự chuyển hóa WST-1 tetrazolium thành formazan bởi enzyme dehydrogenases xảy ra càng mạnh. Mức độ tăng sinh của tế bào có thể định lƣợng thơng qua độ hấp thu OD bƣớc sóng 450 nm).
Quy trình đánh giá mức độ tăng sinh của tế bào bằng WST-1 đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Tế bào đƣợc chuẩn bị với mật độ 5 x
103 tế bào/giếng trong đĩa 96 giếng. Môi trƣờng nuôi cấy cũ đƣợc loại bỏ và tế bào đƣợc rửa lại 2 lần bằng dung dịch PBS. Sau đó, dung dịch WST-1 (10 µl đƣợc thêm vào m i giếng trong điều kiện vô trùng, tránh ánh sáng. Mẫu tế bào đƣợc trộn đều bằng máy lắc với tốc độ 300-500 v/p trong 30 giây và ủ ở 37°C và 5% CO2. Sau 4 giờ, mẫu đƣợc lắc đều trong 20 giây và xác định giá trị hấp thu (OD) bằng máy đọc ELISA tại bƣớc sóng 450 nm. Kết quả đƣợc xác định thơng qua giá trị OD của m i mẫu. Giá trị OD đƣợc sử dụng để phân tích tỉ lệ tế bào sống hay tỉ lệ ức chế tế bào tăng sinh theo các công thức sau:
( ) ( OD mẫu
OD đối chứng)
( ) ( OD mẫu
OD đối chứng)
B. Đánh giá sự phân mảnh của tế bào
Đánh giá sự phân mảnh của nhân tế bào MCF-7 sau khi xử lý với cao chiết Ngải trắng.
Phƣơng pháp đánh giá mức độ apoptosis của tế bào
Apoptosis là quá trình tế bào chết theo chƣơng trình. Sự phân mảnh và sự cơ đặc của DNA trong nhân tế bào là một trong những dấu hiệu đầu tiên nhận biết tế bào đi vào quá trình apoptosis. Hiện tƣợng này có thể quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang khi tế bào đƣợc nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang (DAPI, Hoechst 333342). Bên cạnh sự phân mảnh và cô đặc DNA trong nhân tế bào, một trong những sự kiện xảy ra sớm của quá trình apoptosis là quá trình chuyển vị của màng phosphatidylserine (PS) từ mặt trong màng tế bào ra bề mặt màng tế bào. Annexin V là một protein gắn phospholipid phụ thuộc ion Ca2+ (Ca2+-dependent phospholipid-binding protein), có ái lực cao với PS. Annexin V đƣợc gắn với fluorescein isothiocyante FITC để đánh dấu vị trí PS trên bề mặt tế bào. Ngoài ra, thành phần propidium iodide (PI) có tác dụng đánh dấu những tế bào necrosis dựa
vào phát hiện những tổn thƣơng trên màng tế bào. Do vậy, các tế bào apoptosis hay necrosis có thể đƣợc phát hiện thơng qua tín hiệu huỳnh quang của PI và Annexin V-FITC bằng kỹ thuật FACS trên hệ thống máy flow cytometry.
Trong nghiên cứu này, sự apoptosis của tế bào đƣợc đánh giá bằng bộ kit Annexin V-FITC apoptosis detection của Sigma Aldrich. Quy trình đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Trƣớc tiên, tế bào đƣợc thu nhận và tách thành tế bào đơn bằng cách sử dụng trypsin/EDTA 0,25 . Sau đó, tế bào đƣợc rửa lại 2-3 lần với dung dịch PBS. Tế bào đƣợc huyền phù trong dung dịch đệm 1X (đi kèm theo bộ kit) ở mật độ tế bào 1 x 106 tế bào/ml. Khoảng 200 l huyền phù tế bào đƣợc chuyển vào ống nghiệm chuyên dụng dùng cho máy FACS . Sau đó, dung dịch Annexin V-FITC 10 l và propidium iodide PI, 10 l đƣợc cho vào m i ống nghiệm chứa tế bào. Mẫu đƣợc lắc đều trong 20 giây và ủ ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau 20 phút, dung dịch đệm 1X 300 l đƣợc bổ dung vào m i ống chứa tế bào. Tế bào đƣợc phân tích q trình apoptosis bằng phần mềm CellQuest Pro trên hệ thống FACS Calibur.
Kết quả đƣợc đánh giá thông qua sự phát huỳnh quang của tế bào sau khi nhuộm kép với Annexin V-FITC đƣợc dò ra bởi kênh FL-1 và PI đƣợc dò ra bởi kênh FL-2). Sự kết hợp giữa Annexin V và PI có thể giúp phân biệt đƣợc tế bào apoptosis sớm Annexin V dƣơng tính, PI âm tính), tế bào apoptosis muộn Annexin V dƣơng tính, PI dƣơng tính , tế bào necrosis Annexin V âm tính, PI dƣơng tính và tế bào sống (Annexin V âm tính, PI âm tính). Tỉ lệ tế bào apoptosis (apoptosis sớm và apoptosis muộn đƣợc định lƣợng bằng phần mềm CellQuest Pro trên hệ thống FACS Calibur của BD Biosciences
C. Xác định khả năng ức chế tế bào ung thƣ vú (MCF7) thông qua biểu hiện gen bax và bcl-2
Phƣơng pháp Realtime-PCR
Những mẫu RNA trữ trong Nitơ lỏng đƣợc sử dụng trong phản ứng real time PCR. 1 l RNA tổng từ m i mẫu cùng với 2 l primer nhƣ trong bảng bên dƣới, 10 l Mix Ro-Lox, 1 l RTAse, trong tổng thể tích là 20 l đối với m i phản ứng. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với 3 mẫu. Chi tiết phản ứng: 1 chu kỳ 45oC trong 15 phút; 1 chu kỳ 95oC trong 2 phút; 40 chu kỳ 95 oC trong 10 phút, nhiệt độ bắt cặp (nhiệt độ bắt cặp đƣợc sử dụng dựa theo các cặp primer nhất định) trong 15 giây, và 62 oC trong 15 giây; và 71 chu kỳ 60oC trong 30 giây. Để so sánh nồng độ của từng mẫu RNA với GAPDH, phƣơng pháp 2Ct đã đƣợc sử dụng.
Bảng 2.2: Mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng trong phản ứng Real time
PCR Gene GenBan k accession number Sequence Position Produ t size (bp) GAPDH NM 002046 F: 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT- 3’ 114-135 223 R: 5’- CTGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ 314-336 R: 5’-ATGGCGGGAGGTAGACTGA-3’ 1319- 1337 Bcl-2 NM 000633 F: 5’-TTCTTTGAGTTCGGTGGGG-3’ 448-466 194 R: 5’-CAGGAGAAATCAAACAGAGGC- 3’ 621-641 Bax NM 138764 F: 5’-CTTTTGCTTCAGGGTTTCATC-3’ 73-93 113 R: 5’-CACTCGCTCAGCTTCTTGGT-3’ 166-185 R: 5’-CCAAATCCTCCAGAACCAAT-3’ 486-505
Xử lý số liệu
Phƣơng pháp One-way analysis of variance ANOVA đƣợc dùng để phân tích phƣơng sai của nhiều nhóm cùng lúc. Việc phân tích thống kê đƣợc thực hiện bằng chƣơng trình Sigma Plot version 11.0