Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
Nghiệm thức 1: Thời gian ly trích 30 phút Nghiệm thức 2: Thời gian ly trích 60 phút Nghiệm thức 3: Thời gian ly trích 90 phút Nghiệm thức 4: Thời gian ly trích 120 phút Địa điểm thí nghiệm: Viện Sinh học nhiệt đới
Phƣơng pháp: Sử dụng phƣơng pháp siêu âm và dung môi ethanol để khảo sát hiệu quả thu nhận phenolic và curcumol.
Lƣợng dung môi ly trích: 40ml
Chỉ tiêu theo d i: hàm lƣợng phenolic tổng số mg/g TLK) và Curcumol (mg/g TLK)
2.3.1.5 Khảo sát tỉ lệ dung môi ly trích
Thí nghiệm đƣợc bố trí theo kiểu hoàn toàn ngẫu nhiên, 8 nghiệm thức và 3 lần lặp lại.
Nghiệm thức 1: T lệ dung mẫu/dung môi là 1/5 Nghiệm thức 2: T lệ dung mẫu/dung môi là 1/10 Nghiệm thức 3: T lệ dung mẫu/dung môi là 1/20 Nghiệm thức 4: T lệ dung mẫu/dung môi là 1/30 Nghiệm thức 5: T lệ dung mẫu/dung môi là 1/40 Nghiệm thức 6: T lệ dung mẫu/dung môi là 1/50 Nghiệm thức 7: T lệ dung mẫu/dung môi là 1/60 Nghiệm thức 8: T lệ dung mẫu/dung môi là 1/70 - Địa điểm thí nghiệm: Viện Sinh học nhiệt đới
- Phƣơng pháp: Sử dụng phƣơng pháp siêu âm và dung môi ethanol để khảo sát hiệu quả thu nhận phenolic và curcumol.
- Chỉ tiêu theo d i: hàm lƣợng phenolic tổng số mg/g TLK và curcumol (mg/g TLK)
2.3.2. Xác định hàm lƣợng hoạt chất trong cao chiết: phenolic, curcumol curcumol curcumol
A. Xác định hàm lƣợng phenolic của cao chiết Tiến hành:
Bảng 2.1: hương pháp x ựng đường chu n và xác đ nh hàm lượng phenolic C chất chuẩn (mg/L) 0 15 30 60 90 120 Mẫu V dd chất chuẩn (µl) 0 50 50 50 50 50 0 V dd ly trích (µl) 0 0 0 0 0 0 50 V dd Folin-Ciocalteu 10%(µl) 250 250 250 250 250 250 250
Lắc đều h n hợp, để yên trong 20s V dd Na2CO3 7.5 M
((µl)
200 200 200 200 200 200 200
Lắc đều h n hợp, để yên trong tối 2h, ở 37⁰C Sau đó xác định độ hấp thụ ở bƣớc sóng λ = 740 nm
Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2013.
B. Xác định hàm lƣợng curcumol của cao chiết
Xác định hàm lƣợng curcumol bằng phƣơng pháp HPLC Cao và cs, 2007):
Dung dịch chuẩn curcumol 5-100ppm , phân tích HPLC đƣợc thực hiện trên hệ thống 2995 Water, USA , đƣợc nối với đầu d DAD 2996. Phân tách sắc k sử dụng cột C18 (250 × 4.6 mm, 5 𝜇m , dung môi pha động gồm h n hợp acetonitrile:methanol:H2O:acid phosphoric tỉ lệ 550:225:225:1. Tốc độ d ng 1 ml/phút, thể tích mẫu tiêm là 10 L. Kết quả ghi nhận ở bƣớc sóng 210 nm.
Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2013.
2.3.3. Xác định hoạt tính kháng oxy hoá của cao chiết
Xác định khả năng kháng oxy hóa bằng phƣơng pháp nhặt gốc tự do DPPH [68]:
H n hợp phản ứng gồm 100 l mẫu dịch chiết và 100 l dung dịch DPPH 0,1 mM (hòa tan trong ethanol 80%). Trộn đều h n hợp và đem ủ tối trong 30 phút ở nhiệt độ 37⁰C. Sau đó mẫu đƣợc đem đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng 517 nm bằng máy đo quang phổ Elisa. Tỉ lệ phần trăm nhặt gốc tự do DPPH của các mẫu đƣợc tính theo công thức:
% nhặt gốc tự do DPPH = [1- (ODmẫu / ODmẫu kiểm soát)]× 100
Giá trị IC50 là nồng độ hiệu quả mà ở đó gốc DPPH đã đƣợc bắt 50% và thu đƣợc bằng cách nội suy từ phân tích hồi quy tuyến tính. Giá trị IC50 càng thấp thì hoạt tính kháng oxy hóa càng cao.
Bố trí thí nghiệm
Cao chiết đƣợc pha theo các nồng độ 25, 50, 75 và 100 µg/ml, và đƣợc tiến hành theo bảng 2.2, m i thí nghiệm đƣợc lặp lại 3 lần.
Bảng 2.2: ác nghiệm thức tiến hành xác đ nh khả năng kháng ox hó củ c o chiết
Nồng độ mẫu (µg/ml) 25 50 75 100
Thể tích mẫu (µl) 100 100 100 100 Thể tích DPPH 0,1 mM (µl) 100 100 100 100
Lắc đều, ủ tối 30 phút, đo mật độ quang OD517nm Lắc đều, ủ tối 30 phút, đo mật độ quang OD517nm
Xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng phần mềm Microsoft Excel 2013.
2.3.4. Xác định hoạt tính apoptosis của cao chiết trên mô hình tế bào ung thƣ vú bào ung thƣ vú
A. Kiểm tra độc tế bào
Kiểm tra độc tế bào của cao chiết Ngải trắng trên dòng tế bào MCF-7. Phƣơng pháp giải đông và nuôi cấy tăng sinh tế bào
Các dòng tế bào đƣợc cung cấp bởi ATCC hay công ty CLS trong các ống đông lạnh (cryovial). Các ống tế bào đông lạnh đƣợc giải đông nhanh ở 37oC trong bể ổn nhiệt từ 2-3 phút dựa trên phƣơng pháp “đông lạnh chậm,
giải đông nhanh”. Huyền phù tế bào đƣợc chuyển vào ống ly tâm (15 ml) có bổ sung môi trƣờng nuôi cấy phù hợp với 10% FBS và 0,5% kháng sinh Pen/Strep, sau đó ly tâm 1500 v/p, loại bỏ dịch nổi và thu lại cặn tế bào ở đáy ống ly tâm. Các tế bào đƣợc huyền phù vào môi trƣờng nuôi cấy phù hợp. Dòng tế bào MCF-7 đƣợc nuôi cấy trong môi trƣờng DMEM/F12. Toàn bộ dung dịch tế bào huyền phù đƣợc chuyển vào đĩa nuôi cấy tế bào 100 mm và nuôi cấy ở 37oC và 5% CO2. Sau 12-24 giờ, môi trƣờng cũ đƣợc loại bỏ và môi trƣờng nuôi cấy phục hồi mới với 20% FBS đƣợc thay thế. Tế bào tiếp tục đƣợc nuôi cấy phục hồi từ 4-7 ngày trƣớc khi chuyển sang giai đoạn tăng sinh. Tế bào đƣợc nuôi cấy tăng sinh với môi trƣờng tăng sinh phù hợp, bổ sung 10% FBS và 0,5% kháng sinh Pen/Strep. Môi trƣờng nuôi cấy tế bào đƣợc thay từ 2-3 lần/tuần. Khi tế bào đạt 80% diện tích bề mặt nuôi cấy, tế bào đƣợc cấy chuyển bằng Trypsin/EDTA 0,25% theo tỉ lệ 1:3. Sau đó, tế bào tiếp tục đƣợc nuôi cấy tăng sinh và thu nhận khi đạt đƣợc lƣợng tế bào cần thiết.
Phƣơng pháp đánh giá mức độ tăng sinh của tế bào
Để đánh giá sự tăng sinh tế bào, nghiên cứu sử dụng bộ kit WST-1 (Roche). Nguyên tắc hoạt động của bộ kit dựa trên phản ứng phân cắt hợp chất WST-1 tetrazolium bởi enzyme dehydrogenases có trong ty thể tế bào. Dehydrogenases là một enzyme trong chu i hô hấp tế bào, chuyển hóa WST- 1 tetrazolium thành formazan có màu vàng và hấp thu bƣớc sóng 450 nm. Tế bào càng phát triển nhanh thì quá trình hô hấp và chuyển hóa của tế bào xảy ra mạnh, dẫn đến sự chuyển hóa WST-1 tetrazolium thành formazan bởi enzyme dehydrogenases xảy ra càng mạnh. Mức độ tăng sinh của tế bào có thể định lƣợng thông qua độ hấp thu OD bƣớc sóng 450 nm).
Quy trình đánh giá mức độ tăng sinh của tế bào bằng WST-1 đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Tế bào đƣợc chuẩn bị với mật độ 5 x
103 tế bào/giếng trong đĩa 96 giếng. Môi trƣờng nuôi cấy cũ đƣợc loại bỏ và tế bào đƣợc rửa lại 2 lần bằng dung dịch PBS. Sau đó, dung dịch WST-1 (10 µl đƣợc thêm vào m i giếng trong điều kiện vô trùng, tránh ánh sáng. Mẫu tế bào đƣợc trộn đều bằng máy lắc với tốc độ 300-500 v/p trong 30 giây và ủ ở 37°C và 5% CO2. Sau 4 giờ, mẫu đƣợc lắc đều trong 20 giây và xác định giá trị hấp thu (OD) bằng máy đọc ELISA tại bƣớc sóng 450 nm. Kết quả đƣợc xác định thông qua giá trị OD của m i mẫu. Giá trị OD đƣợc sử dụng để phân tích tỉ lệ tế bào sống hay tỉ lệ ức chế tế bào tăng sinh theo các công thức sau:
( ) ( OD mẫu
OD đối chứng)
( ) ( OD mẫu
OD đối chứng)
B. Đánh giá sự phân mảnh của tế bào
Đánh giá sự phân mảnh của nhân tế bào MCF-7 sau khi xử lý với cao chiết Ngải trắng.
Phƣơng pháp đánh giá mức độ apoptosis của tế bào
Apoptosis là quá trình tế bào chết theo chƣơng trình. Sự phân mảnh và sự cô đặc của DNA trong nhân tế bào là một trong những dấu hiệu đầu tiên nhận biết tế bào đi vào quá trình apoptosis. Hiện tƣợng này có thể quan sát dƣới kính hiển vi huỳnh quang khi tế bào đƣợc nhuộm với thuốc nhuộm huỳnh quang (DAPI, Hoechst 333342). Bên cạnh sự phân mảnh và cô đặc DNA trong nhân tế bào, một trong những sự kiện xảy ra sớm của quá trình apoptosis là quá trình chuyển vị của màng phosphatidylserine (PS) từ mặt trong màng tế bào ra bề mặt màng tế bào. Annexin V là một protein gắn phospholipid phụ thuộc ion Ca2+ (Ca2+-dependent phospholipid-binding protein), có ái lực cao với PS. Annexin V đƣợc gắn với fluorescein isothiocyante FITC để đánh dấu vị trí PS trên bề mặt tế bào. Ngoài ra, thành phần propidium iodide (PI) có tác dụng đánh dấu những tế bào necrosis dựa
vào phát hiện những tổn thƣơng trên màng tế bào. Do vậy, các tế bào apoptosis hay necrosis có thể đƣợc phát hiện thông qua tín hiệu huỳnh quang của PI và Annexin V-FITC bằng kỹ thuật FACS trên hệ thống máy flow cytometry.
Trong nghiên cứu này, sự apoptosis của tế bào đƣợc đánh giá bằng bộ kit Annexin V-FITC apoptosis detection của Sigma Aldrich. Quy trình đƣợc tiến hành theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất. Trƣớc tiên, tế bào đƣợc thu nhận và tách thành tế bào đơn bằng cách sử dụng trypsin/EDTA 0,25 . Sau đó, tế bào đƣợc rửa lại 2-3 lần với dung dịch PBS. Tế bào đƣợc huyền phù trong dung dịch đệm 1X (đi kèm theo bộ kit) ở mật độ tế bào 1 x 106 tế bào/ml. Khoảng 200 l huyền phù tế bào đƣợc chuyển vào ống nghiệm chuyên dụng dùng cho máy FACS . Sau đó, dung dịch Annexin V-FITC 10 l và propidium iodide PI, 10 l đƣợc cho vào m i ống nghiệm chứa tế bào. Mẫu đƣợc lắc đều trong 20 giây và ủ ở nhiệt độ phòng, tránh ánh sáng. Sau 20 phút, dung dịch đệm 1X 300 l đƣợc bổ dung vào m i ống chứa tế bào. Tế bào đƣợc phân tích quá trình apoptosis bằng phần mềm CellQuest Pro trên hệ thống FACS Calibur.
Kết quả đƣợc đánh giá thông qua sự phát huỳnh quang của tế bào sau khi nhuộm kép với Annexin V-FITC đƣợc dò ra bởi kênh FL-1 và PI đƣợc dò ra bởi kênh FL-2). Sự kết hợp giữa Annexin V và PI có thể giúp phân biệt đƣợc tế bào apoptosis sớm Annexin V dƣơng tính, PI âm tính), tế bào apoptosis muộn Annexin V dƣơng tính, PI dƣơng tính , tế bào necrosis Annexin V âm tính, PI dƣơng tính và tế bào sống (Annexin V âm tính, PI âm tính). Tỉ lệ tế bào apoptosis (apoptosis sớm và apoptosis muộn đƣợc định lƣợng bằng phần mềm CellQuest Pro trên hệ thống FACS Calibur của BD Biosciences
C. Xác định khả năng ức chế tế bào ung thƣ vú (MCF7) thông qua biểu hiện gen bax và bcl-2
Phƣơng pháp Realtime-PCR
Những mẫu RNA trữ trong Nitơ lỏng đƣợc sử dụng trong phản ứng real time PCR. 1 l RNA tổng từ m i mẫu cùng với 2 l primer nhƣ trong bảng bên dƣới, 10 l Mix Ro-Lox, 1 l RTAse, trong tổng thể tích là 20 l đối với m i phản ứng. Phản ứng PCR đƣợc tiến hành với 3 mẫu. Chi tiết phản ứng: 1 chu kỳ 45oC trong 15 phút; 1 chu kỳ 95oC trong 2 phút; 40 chu kỳ 95 oC trong 10 phút, nhiệt độ bắt cặp (nhiệt độ bắt cặp đƣợc sử dụng dựa theo các cặp primer nhất định) trong 15 giây, và 62 oC trong 15 giây; và 71 chu kỳ 60oC trong 30 giây. Để so sánh nồng độ của từng mẫu RNA với GAPDH, phƣơng pháp 2Ct đã đƣợc sử dụng.
Bảng 2.2: Mồi xuôi và mồi ngược được sử dụng trong phản ứng Real time PCR Gene GenBan k accession number Sequence Position Produ t size (bp) GAPDH NM 002046 F: 5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTT- 3’ 114-135 223 R: 5’- CTGGAAGATGGTGATGGGATTTC-3’ 314-336 R: 5’-ATGGCGGGAGGTAGACTGA-3’ 1319- 1337 Bcl-2 NM 000633 F: 5’-TTCTTTGAGTTCGGTGGGG-3’ 448-466 194 R: 5’-CAGGAGAAATCAAACAGAGGC- 3’ 621-641 Bax NM 138764 F: 5’-CTTTTGCTTCAGGGTTTCATC-3’ 73-93 113 R: 5’-CACTCGCTCAGCTTCTTGGT-3’ 166-185 R: 5’-CCAAATCCTCCAGAACCAAT-3’ 486-505
Xử lý số liệu
Phƣơng pháp One-way analysis of variance ANOVA đƣợc dùng để phân tích phƣơng sai của nhiều nhóm cùng lúc. Việc phân tích thống kê đƣợc thực hiện bằng chƣơng trình Sigma Plot version 11.0
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. HOÀN THIỆN QUY TRÌNH LY TRÍCH THU NHẬN CAO CHIẾT TỪ CỦ CÂY NGẢI TRẮNG
3.1.1. Xác định hàm lƣợng nƣớc
Bảng 3.1: Hàm lượng nước của củ Ngải trắng
Mẫu Hàm lƣợng nƣớc (%TLT)
Củ Ngải trắng 90,35 ± 0,53
Mỗi giá tr trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại ± Độ lệch chu n (Mean ± SD)
Kết quả từ bảng 3.1 cho thấy củ Ngải trắng có hàm lƣợng nƣớc khá cao, đạt 90,35 . Năm 2003, Niranjan và cộng sự khi nghiên cứu về thành phần hóa học của chi Curcuma, đã công bố hàm lƣợng nƣớc trong củ tƣơi nằm trong khoảng 90,2 – 91,3%, còn lá tƣơi là 88,7 – 91,2% [69].
Kết quả này cũng có sự tƣơng đồng với một nghiên cứu của Maizura và cộng sự (2011) [84]. Các nhà khoa học này đã công bố hàm lƣợng nƣớc trong củ của thảo dƣợc Curcuma longa đạt 91% (Maizura và cs., 2011) [84], đây là một loài cùng chi với Ngải trắng mà chúng tôi đang tiến hành nghiên cứu.
Hàm lƣợng nƣớc trong thực vật phụ thuộc vào điều kiện sinh sống, nhƣ điều kiện thời tiết, nhiệt độ môi trƣờng, hay lƣợng nƣớc đƣợc cung cấp thông qua rễ, lá; ngoài ra, hàm lƣợng nƣớc còn phụ thuộc vào tuổi của mẫu, các cây non chứa nhiều nƣớc hơn cây già hoặc do thu mẫu từ những bộ phận khác nhau s có hàm lƣợng nƣớc khác nhau. Thông thƣờng các cơ quan sinh dƣỡng nhƣ lá, củ, quả s có hàm lƣợng nƣớc cao hơn rất nhiều các cơ quan sinh sản, ví dụ nhƣ hạt. Sự khác biệt về thời gian lấy mẫu cũng s cho ra kết quả khác biệt, ví dụ nhƣ hàm lƣợng nƣớc của mẫu vào buổi trƣa nắng thƣờng thấp hơn buổi sáng.
Nhƣ vậy, tùy từng bộ phận khác nhau, hay điều kiện ngoại cảnh khác nhau mà hàm lƣợng nƣớc trong mẫu khác nhau.
3.1.2. Xác định hàm lƣợng khoáng
Tro là thành phần còn lại của thực vật sau khi nung cháy hết các chất hữu cơ. Tro thật sự chỉ gồm các loại muối khoáng có trong thực vật, do đó hàm lƣợng tro tổng số hay c n đƣợc gọi là hàm lƣợng khoáng tổng số của thực vật. Trong trƣờng hợp mẫu có lẫn các chất bẩn đất, cát) muốn có độ tro khoáng thật sự phải loại trừ đất cát và những chất không phải là muối khoáng mà lại không nung cháy ở nhiệt độ quy định.
Định lƣợng hàm lƣợng khoáng có mặt trong thực vật đóng vai trò quan trọng, bởi vì chất lƣợng của nhiều loại dƣợc liệu phụ thuộc vào lƣợng khoáng chất bên trong nó, ngoài ra khoáng cũng đóng vai tr quan trọng đối với dịch bệnh và các quá trình thoái hóa, cũng có thể ngăn ngừa và giảm thiểu ảnh hƣởng của ô nhiễm môi trƣờng. Lƣợng tro còn lại sau khi nung mẫu thực vật khác biệt đáng kể theo sự thay đổi của tuổi và từng bộ phận (R.K.Momin and Kadam V.B, 2011) [85].
Bảng 3.2: Hàm lượng tro khoáng của củ Ngải trắng
Mẫu Hàm lƣợng tro
khoáng (%TLK)
Bột Ngải trắng 7,86 ± 0,15
Mỗi giá tr trong bảng là trung bình của 3 lần lặp lại ± Độ lệch chu n (Mean ± SD)
Kết quả từ bảng 3.2 cho thấy bột củ Ngải trắng có hàm lƣợng khoáng đạt 7,86%. Kết quả này tƣơng đồng với một báo cáo của Niranjan và cộng sự năm 2003. Niranjan và cộng sự khi nghên cứu về thành phần hóa học của chi
Curcuma, đã công bố hàm lƣợng tro khoáng của củ nằm trong khoảng 6,9 – 9,8% [69].
Kết quả hàm lƣợng khoáng của Ngải trắng thu đƣợc thấp hơn các nghiên cứu trên thế giới về một số loài khác thuộc cùng chi Curcuma. Năm 2011, Paliwal và cộng sự đã công bố hàm lƣợng tro khoáng của củ Curcuma caesia Roxb. là 9,03% [70]. Tiếp đó, năm 2015, nghiên cứu của Pawar và cộng sự