5. KẾT LUẬN VÀ đỀ NGHỊ
3.2Danh sách các chủng vi khuẩn ựược sử dụng ựể lây nhiễm nhân tạo
STT Kắ hiệu Isolate
Phân lập Từ giống
địa ựiểm thu thập mẫu bệnh
2 911 HAU 10134-3 Nếp tân Thuận Châu (Sơn la) 3 R7 Nhị ưu 838 Quỳnh Giang Ờ Quỳnh
Lưu (Nghệ An) 4 893 HAU 10132-5 Tẻ ựỏ Hải Dương
5 997 HAU 10147-6 Khang dân Diễn Kỳ - Diễn Châu (Nghệ An)
6 950 HAU 10141-9 Nhị ưu 838 Cường Thịnh Ờ Yên kì (Yên Bái)
7 507 HAU 0808-8 Nếp thơm Vinh Hống Ờ Bình Giang (Hải Dương)
8 R14 - Hưng Hà (Thái Bình)
9 918 HAU 10131-1 - Nam Trực (Nam định) 10 948 HAU 10141-7 - Nông Cống (Thanh Hóa)
Dấu Ộ-Ợ thể hiện phân lập từ nhiều giống.
Vi khuẩn ựược bảo quản trong môi trường Skim milk và pharaphin lỏng. Dung dịch vi khuẩn có nồng ựộ từ 108 Ờ 109/ml. Vi khuẩn ựược ựem thử ựộc tắnh sau khi bảo quản bằng cách lây nhiễm thử trên dòng nhiễm chuẩn IR24.
- đánh giá khả năng kháng nhiễm bệnh bạc lá
Thắ nghiệm lây nhiễm nhân tạo ựược tiến hành bằng cách cắt ựầu lá lúa khi bắt ựầu có ựòng (trước trỗ bông 20 ngày) là thời kỳ cây lúa mẫn cảm nhất với bệnh. Toàn bộ ựầu lá xanh của một khóm lúa ựược cắt sâu 3 - 5cm bằng kéo nhúng dung dịch vi khuẩn.
Mỗi một khóm tương ứng với một chủng vi khuẩn nêu trên.
đánh giá khả năng kháng bệnh của từng giống bằng cách ựo chiều dài vết bệnh (cm) sau 18 ngày lây nhiễm, sau ựó ựánh giá phản ứng với vi khuẩn gây bệnh theo phương pháp ựo chiều dài vết bệnh theo quy ựịnh của IRRI như sau:
Chiều dài vết bệnh (cm) Phản ứng
< 8 Kháng - Resistant (R)
8 Ờ 12 Nhiễm vừa Ờ Moderately resistant (M) > 12 Nhiễm nặng - Suscepptible (S)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 40
đánh giá khả năng kháng bằng so sánh với phổ kháng nhiễm của các mẫu giống với các dòng ựẳng gen mang gen kháng.
3.5.2 Kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR Các bước tiến hành tách DNA như sau: Các bước tiến hành tách DNA như sau:
Bước 1: Thu ngắt mẫu lá lúa khỏe dài khoảng 2cm bỏ vào ống eppendorf có dung tắch 1.5ml, ựánh dấu tên giống rồi bỏ vào ựá lạnh.
Bước 2: Trong phòng thắ nghiệm các cối sứ ựã ựược hấp khử trùng ựặt trong ựá lạnh. Các mẫu lá ựược cắt nhỏ 0.5cm rồi bỏ vào cối sứ.
Bước 3: Nhỏ 400ộl dung dịch chiết xuất ADN vào cối rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá ựến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang màu xanh ựen, chứng tỏ tế bào lá ựã vỡ và diệp lục ựược giải phóng ra.
Bước 4: Cho thêm 400ộl dung dịch chiết xuất ADN vào và trộn lẫn và chuyển 400ộl vào ống eppendorf ựã ựược ựánh dấu.
Bước 5: Cho vào ống eppendorf 700ộl hỗn hợp Phenol: Chlorofom: Isoamylalcohol (25:24:1). Sau ựó ly tâm 13000 vòng/phút trong 7 phút ở 4oC, rồi hút phần dung dịch phắa trên sang ống eppendorf mới ựã ựược ựánh dấu tương ứng.
Bước 6: Cho 600ộl hỗn hợp Chlorofom: Isoamylalcohol (24 : 1) lắc ựều sau ựó ly tâm 7phút với tốc ựộ 13000 vòng/phút. Sau ựó hút phần dung dịch ở trên vào ống eppendorf mới ựã ựánh dấu tương ứng.
Bước 7: Cho 800ộl Ethanol (96%) (hoặc 600ộl Isopropanol), trộn ựều sau ựó ly tâm 7 phút với tốc ựộ 13000 vòng/phút. Sau ựó ựỗ phần dung dịch phắa trên giữ lại phần kết tủa dưới ựáy ống nghiệm.
Bước 8: Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 41 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
* Phản ứng PCR
Thành phần cho phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tắch (ộl) 1 Gotaq Colorless master mix 12.5
2 Primer F 1
3 Primer R 1
4 Free water 9.5
5 DNA template 1
Kắ hiệu, trình tự và nguồn gốc các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
KH mồi Gen Trình tự mồi Enzyme Tác giả
Npb181 Xa4 R5
Ỗ
GTGCTATAAAAGGCATTCGGG3Ỗ
F5ỖATGGATCGATCTTCACGAGG3Ỗ - Ma Bo-Jun et al, 1999 P5 Xa7 F5
Ỗ
CAGCAATTCACTGGAGTAGTGGTT3Ỗ
R5ỖCATCACGGTCACCGCCATATCGGA3Ỗ - Porter et al.,1996 PG556 xa5 R5
Ỗ
TAGCTGCTGCCGTGCTGTGC3Ỗ
F5ỖAATATTTCAGTGTGCATCTC3Ỗ DraI Yoshimura
et al.,1995
Dẫn theo IRRI: IRRI: Planning Breeding Programs for Impact
- Thành phần 20 ộl dung dịch của phản ứng PCR gồm có: 12,24ộl nước cất, 0,1ộl Taq DNA Polymerase, 2,0ộl 10X buffer, 1,5ộl của 50 mM MgCl2, 0,16ộl của dNTPs 25mM, 1ộl mỗi mồi, 1ộl DNA nguyên bản.
- PCR của gen Xa4 và Xa7 ựược thực hiện theo chu kỳ nhiệt: 94o C trong 1 phút 560 C trong 1 phút, 720C trong 2 phút và 720C trong 8 phút.
- PCR của gen xa5 ựược thực hiện theo chu kỳ nhiệt: 94oC trong 4 phút, 34 chu kỳ 940C trong 1 phút 550C trong 1 phút, 720C trong 1 phút 50 giây và 720C trong 7 phút.
Sau ựó sản phẩm của PCR ựược cắt bằng emzyme DraI. 15ộl phản ứng gồm có 10ộl sản phẩm PCR, 0,3ộl emzyme DraI 10 unit/ộl; 1,5ộl của buffer B; 3,2ộl nước. Hỗn hợp ựược ủ ở 370C ắt nhất trong 6 giờ.
- Sản phẩm PCR ựược thực ựiện di trên gen agarose 1,5%. Bản gen ựược nhuộm bằng ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 42
3.6 đánh giá một số ựặc ựiểm nông sinh học quan trọng
Các ựặc ựiểm nông sinh học ựược khảo sát theo IRRI standard evaluation system for rice, 2002 [36].
* Nhóm tắnh trạng cơ bản gồm 7 chỉ tiêu: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Tổng thời gian sinh trưởng - Thời gian từ gieo tới trổ bông - Chiều cây cao cuối cùng - Chiều dài bông
- Số nhánh tối ựa, số nhánh hữu hiệu/khóm - Kiểu ựẻ nhánh, khả năng ựẻ nhánh
* Năng suất và các yếu tố cấu thành năng suất gồm 5 chỉ tiêu:
- Số bông hữu hiệu/khóm - Số hạt/bông
- Tỉ lệ hạt chắc
- Khối lượng 1000 hạt - Năng suất cá thể
* Nhóm tắnh trạng ựặc trưng cho hình thái gồm 6 chỉ tiêu:
- Màu phiến lá, màu bẹ lá
- Chiều dài lá ựòng, chiều rộng lá ựòng, - Góc lá ựòng
- độ tàn lá ựòng (ựiểm)
* Nhóm chỉ tiêu sâu bệnh hại khác với bệnh bạc lá
- Các sâu bệnh khác: ựạo ôn, khô vằn, rầy nâu, .... ựược ựánh giá trong ựiều kiện tự nhiên theo IRRI - SES 1996.
* Dung lượng mẫu theo dõi
+ Các chỉ tiêu theo dõi ựều nghiên cứu 10 khóm/ dòng, giống, lấy ngẫu nhiên, riêng các chỉ tiêu về năng suất thì lấy 20 khóm/giống (10 khóm không lây nhiễm nhân tạo và 10 khóm lây nhiễm nhân tạo)
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 43
3.7 Xử lý số liệu và chọn lọc dòng, giống lúa triển vọng
+ Tiến hành xử lý số liệu theo phần mềm Selindex, xử lý thống kê trên IRISATS 5.0.
+ Chương trình IRISATS 5.0 ựược xử lý cho giống ựối chứng Khang Dân 18 ựược bố trắ ngẫy nhiên với 3 lần lặp lại. Lấy sai số của ựối chứng làm sai số cho toàn thắ nghệm khảo sát ựể so sánh sự sai khác giữa các dòng (theo Nguyễn Thị Lan,[10]).
+ Áp dụng chương trình chọn lọc theo chỉ số Selection Index ver 1.0 (theo Nguyễn đình Hiền [4]).
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 44
B Phần 2: Chọn lọc các cá thể tốt có tiềm năng năng suất cao và chứa gen kháng bạc lá hữu hiệu ở quần thể phân ly F2 của một số tổ hợp lai.
* Nội dung
- Chọn lọc từ quần thể phân ly F2 một số cá thể có tiềm năng năng suất cao và mang gen kháng bệnh bạc lá hữu hiệu.
* Vật liệu
- Danh sách 2 quần thể phân ly ở thế hệ F2 tham gia thắ nghiệm. STT Nguồn gốc bố mẹ Ghi chú
1 PA2 x IRBB5
PA2 chứa gen Xa7
làm mẹ, IRBB5 chứa gen xa5
2 T65 -1 x IRBB7
T65-1 chứa gen Xa4 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
làm mẹ và IRBB7 chứa gen Xa7
* Bố trắ thắ nghiệm
Mỗi quần thể phân ly cấy 10 hàng, 15m2 cho một quần thể và cấy tuyệt ựối một nhánh/khóm (tạo lập 1 dòng mới có khả năng kháng bạc lá sau này), Mật ựộ cấy 35 khóm/m2 ( hàng cách hàng 17cm, cây cách cây 17cm).
* Thời gian
Thực hiện từ tháng 1/2011 Ờ 7/2011 (Vụ xuân 2011)
* điều kiện thắ nghiệm, các bước kiểm tra gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR (các bước tách DNA, thành phần cho phản ứng, mồi và trình tự mồi) giống như Phần 1.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 45
* Các bước chọn lọc
Giai ựoạn Tiêu chuẩn chọn Số cá thể chọn Ghi chú
Giai ựoạn kết thúc ựẻ nhánh hữu hiệu + đẻ nhánh gọn, + Thấp cây + Có 7 Ờ 8 nhánh hữu hiệu. + Không sâu bệnh + Cây chung quanh còn nguyên.
Tiến hành cắm cọc theo dõi 30 khóm trong 1 quần thể phân ly.
Tiến hành tách DNA các khóm ựược dấu và tiến hành theo dõi tiếp tục. Giai ựoạn trỗ bông + Bông trỗ tập trung + Trỗ ựều, nhanh + Bằng cổ bông + Có từ 6 Ờ 7 bông trỗ. Tiến hành lọc bớt các cá thể trong ựủ tiêu chuẩn trong quần thể, chọn lọc còn 20 cá thể.
Tiếp tục theo dõi, sàng lọc bớt số cá thể ựánh dấu. Giai ựoạn chắn + Chọn các khóm có 5 Ờ 6 bông hữu hiệu, khỏe mạnh, không sâu bệnh. + Chọn khóm có chiều cao < 110 cm, năng suất cá thể là > 18 g. + TGST ngắn < 120 ngày
+ Bông to, mỗi bong có từ 150 Ờ 250 hạt chắc
+ Tiến hành chọn lọc khoảng 15 cá thể ngoài ựồng rộng, sau khi ựo ựếm các chỉ tiêu năng suất chọn 7 - 10 cá thể, ựạt tiêu chuẩn ựề ra.
Sau khi theo dõi năng suất, TGST, chều cao cây, số bông hữu, tiến hành lọc bớt các cá thể. Từ các cá thể triển vọng chọn ựược chúng tôi xác ựịnh khả năng mang gen kháng bạc lá.
Ghi chú: Ngoài ra những chỉ tiêu nông sinh học cơ bản như chiều cao cây, NSLT, NSTT, số bông hữu hiệu/khóm, số hạt trên bông, Ầ.về phương pháp giống như thắ nghiệm khảo sát tập ựoàn ựã nêu ở phần 1 trong phần nội dung và phương pháp nghiên cứu này.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 46
4. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU, THẢO LUẬN
A KHẢO SÁT TẬP đOÀN
4.1 Năng suất và các ựặc ựiểm nông sinh học
4.1.1 Thời gian sinh trưởng
Thời gian sinh trưởng (TGST) của cây lúa ựược tắnh từ khi gieo ựến khi 85% số hạt/bông chắn hoàn toàn. để hoàn thành chu kỳ sống, cây lúa phải trải qua rất nhiều giai ựoạn sinh trưởng, phát triển khác nhau. Mỗi giai ựoạn sinh trưởng ựều có vai trò nhất ựịnh tới việc hình thành năng suất và chất lượng lúa gạo. TGST của cây lúa dài hay ngắn còn phụ thuộc vào nhiều yếu tố: giống, thời tiết, mùa vụ, ựiều kiện chăm sóc,Ầ TGST là một chỉ tiêu quan trọng và có ý nghĩa trong việc bố trắ thời vụ, cơ cấu cây trồng và phát huy nguồn lực của ựất canh tác. đặc biệt lúa thuần trồng vụ mùa liên quan chặt chẽ tới hệ thống canh tác 3 vụ trong ựó vụ ựông Bắc bộ ựang ngày ngày càng chiếm thu nhập chắnh trong năm.
Căn cứ vào TGST mà chia thành các giống lúa dài ngày, trung bình hay ngắn ngày. Nhìn chung thời gian sinh trưởng quá dài hay quá ngắn ựều không cho năng suất cao, TGST quá ngắn sẽ làm giảm tắch lũy chất khô giảm năng suất, ngược lại nếu TGST kéo dài thì khó tránh khỏi ảnh hưởng xấu của thiên tai, thời tiết..
Qua quá trình theo dõi thời gian sinh trưởng của các mẫu giống tham gia thắ nghiệm, chúng tôi thu ựược kết quả ựược trình bày ở Bảng 4.1.
Kết quả theo dõi cho thấy các dòng, giống khảo sát trong vụ mùa năm 2010 có thời gian sinh trưởng biến ựộng từ 127 Ờ 137 ngày. Theo Nguyễn Văn Hiển [5] nhóm giống lúa có thời gian sinh trưởng từ 121- 136 ngày là thuộc nhóm có TGST trung bình, như vậy có 30/31 mẫu thuộc nhóm sinh trưởng trung bình, 1 mẫu giống thuộc nhóm sinh trưởng dài ngày là dòng PA1
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 47