2. TỔNG QUAN VỀ VẤN đỀ NGHIÊN CỨU
2.2.3Ứng dụng chỉ thị phân tử trong chọn tạo giống kháng bệnh bạc lá
a) Khái niệm về chỉ thị phân tử
Một ựoạn DNA ựược sử dụng ựể phân biệt sự khác nhau về kiểu hình giữa các cá thể, dòng, giống và giữa các loài ựược coi là phương pháp chỉ thị phân tử ựánh dấu gen.
Khả năng ứng dụng của chị thị phân tử trong công tác giống:
- đánh giá tắnh ựa dạng sinh học của vi sinh vật, ựịnh danh chắnh xác các cá thể ựưa vào chương trình chọn tạo giống.
- đánh giá sự ựồng dạng và sai khác về di truyền giữa các cá thể chọn làm bố mẹ với mục ựắch chọn tạo ra các bố mẹ có sự khác biệt ựủ lớn về di truyền nhưng vẫn có khả năng tạo tổ hợp lai ựể cho thế hệ con có tắnh dị hợp cao, có ưu thế lai lớn, mở rộng nền di truyền.
- Xác ựịnh chỉ thị phân tử ở các locus có liên kết chặt chẽ với các tắnh trạng mong muốn, ựặc biệt với những tắnh trạng khó chọn lọc dùng trong chọn giống số lượng lớn (các ựặc tắnh ựịnh lượng ựược quy ựịnh bởi nhiều gen), phát hiện nhanh chóng chắnh xác sự hiện diện của các gen quy ựịnh những tắnh trạng mong muốn và theo dõi sự di truyền của chúng qua các thế hệ trong chương trình tạo giống.
- đánh giá mức ựộ biến ựộng kiểu gen trong quần thể cây trồng, cật nuôi ựể quyết ựịnh sự cần thiết tiếp tục chọn lọc nhằm ổn ựịnh dòng hay không.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 22
- đánh giá ựộ ựảm bảo chất lượng của các sản phẩm nông nghiệp phục vụ xuất khẩu, xác ựịnh chắnh xác các giống khi có hình thái tương tự, làm cơ sở pháp lý cho các luật về giống cây trồng.
- Chuẩn ựoán các tác nhân gây bệnh phát hiện các tình trạng nhiễm bệnh ẩn.
- Hiện nay có rất nhiều cách ựánh dấu phân tử như sự ựa hình về các isozyme, protein và DNA ựược sử dụng rộng rãi trong nghiên cứu di truyền và chọn giống. Riêng phương pháp chỉ thị phân tử có 10 phương pháp như sau:
- ALP (Amplicon length polymorphism) sự ựa hình về chiều dài những ựoạn DNA ựược nhân lên trên cơ sở nhân gen PCR. Sự ựa hình ựược phát hiện ngay bằng cách ựiện di sản phẩm nhân gen PCR trên gel thường là agarose hoặc acrylamide.
- AFLP (Amiplified fragment length polymorphism) do Vos và cộng sự ựề xuất năm 1995. Phương pháp này tiến hành trên cơ sở: ựầu tiên người ta dùng enzyme cắt giới hạn ựể cắt DNA genome, sau ựó dắnh ựoạn DNA adapter tương ứng với từng enzyme một, rồi thiết kế ựoạn mồi trên cơ sở ựoạn adapter có chọn lọc thêm 1-2 nucleotit ngẫu nhiên gắn thêm vào ựầu 3Ỗ của adapter, rồi dùng kĩ thuật PCR ựể nhân các ựoạn DNA ựược cắt lên tạo ra sự ựa hình phong phú.
- RAPD (Random amplified polymorphic DNA): Sự ựa hình những ựoạn DNA ựược nhân lên một cách ngẫu nhiên trên cớ sở phương pháp PCR dùng một ựoạn mồi.
- DAF (DNA amplificatinon fingerprinting): Phương pháp nhân DNA in vân tay dùng rất nhiều ựoạn mồi ựơn ngắn.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 23
- SSR (Single sequence repeat, microsetellite): Phương pháp nhân hoặc lai những ựoạn DNA lặp ựi lặp lại trong genome ựể tìm ra sự ựa hình. Bằng cách phân cắt DNA genome bằng enzyme giới hạn, phân tách trên ựường ựiện di sau ựó ựem lai với các ựoạn lặp lại ựược tổng hợp nhân tạo hoặc ựược biết trước làm probe.
- AP-PCR (arbitrary primer Ờ PCR) phương pháp dùng hai ựoạn mồi tùy hứng ựể nhân gen DNA bằng PCR, ựể xác ựịnh sự ựa hình của các kiểu gen.
- SSCP (Single strand confortmation polimophism) Sự ựa hình về cấu trúc sợi ựơn DNA,trong genom có một số nơi DNA tại ựó mở xoắn tạo thành hai sợi ựơn. Những nơi mở xoắn ựược sử dụng ựể nghiên cứu sự ựa dạng của genom sinh vật.
- MRDHV (Moderately repeat, dispersed and highly variable DNA, minisatelite) Phương pháp dùng kỹ thuật DNA ựể nghiên cứu sự ựa dạng của những ựoạn DNA, mẩu vệ tinh nhỏ dễ biến ựộng phân tán và lặp ựi lặp lại trong bộ genome của sinh vật.
- STS (Sequence Tagged site) Phương pháp nhân trực tiếp những locus ựã biết bởi mồi PCR ựược thiết kế từ trình tự ựầu cuối của những locus ựặc trưng này cho phép xác ựịnh những vị trắ cần biết bằng các trình tự DNA biết trước. (dẫn theo Nguyễn Minh Thu 2009, [17]).
b) Chỉ thị phân tử liên quan một số gen kháng bệnh bạc lá lúa
Hiện nay với sự phát triển của công nghệ sinh học, người ta ựã xác ựịnh ựược các chỉ thị liên quan ựến tắnh kháng bệnh. đối với bệnh bạc lá, xác ựịnh 7 gen kháng bệnh bạc lá và ựánh dấu bằng phương pháp RFLP (Phan Hữu Tôn tổng hợp năm 2001), kết quả tổng hợp ở bảng sau:
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 24
Bảng 2.2 Bản ựồ liên kết di truyền với gen quy ựịnh tắnh trạng nông sinh học quan trọng với RFLP ựánh dấu
Gen Tắnh trạng Nguồn cho NST RFLP và ựộ
liên kết
Tài liệu tham khảo Xa1 Kháng bạc lá Kogyoku 4 Npb235; 3.3cM Npb197; 7.2cM Yoshimura et al. 1992 Xa2 Kháng bạc lá Tetep 4 Npb235; 3.4cM Npb197;9.4cM Yoshimura et al. 1992 Xa3 Kháng bạc lá Chugoku45 11 Npb181; 2.3cM Npb78; 3.5cM Yoshimura et al. 1992 Xa4 Kháng bạc lá IR20 11 Npb181; 1.7cM Npb78; 1.7cM Yoshimura et al. 1992
Xa5 Kháng bạc lá IR1545-339 5 RG556; 0-1cM McCouch et
al.1991
Xa13 Kháng bạc lá Long grain 8 RZ28; 5.1cM Zhang et (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
al.1994
Xa21 Kháng bạc lá O.longistaminata 11 pTA818,pTA248 0-1cM RG103
Ronald et al. 1992
Dẫn theo Nguyễn Minh Thu [17]
c) Ứng dụng trong chọn giống kháng bệnh bạc lá
Vi khuẩn Xanthomonas oryzae pv. Oyzae có thể ựược xác ựịnh nhanh chóng bằng cách sử dụng các chỉ thị phân tử. Adachi và T. Oku (2000) ựề xuất sử dụng 2 ựoạn mồi XOP-F và XOR-R2 ựể nhân ựoạn DNA, ựoạn DNA này nằm giữa 2 gen tổng hợp nên cấu tử 16S và 23S của ribosome vi khuẩn bạc lá (dẫn theo Phan Hữu Tôn, 2005) [21].
Ngoài ra, các kỹ thuật phân tử RFLP (restriction fragment length polymorphism) cũng ựược áp dụng thành công trong việc ựánh giá sự ựa dạng hay xác ựịnh chủng mới của vi khuẩn Xoo ở Việt Nam, Phillipin, Hàn Quốc và những nước trồng lúa khác (Adhikari, 1995; Yashitola, 1997; Etham Ghasemic, 2008; Phan Hữu Tôn, 2009) [30].
Ngày nay, ựã có nhiều gen quan trọng của các cây trồng ựược phân lập bản ựồ liên kết với các ựoạn DNA genome, ựặc biệt là các gen kháng bệnh ở những cây lương thực chắnh (Melchinger, 1990; Kelly, 1995; Penner và cộng
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 25
sự, 1995; Miklas và cộng sự, 1996) (dẫn theo Trần Minh Thu [17]). Dựa trên bản ựồ này, kỹ thuật chỉ thị phân tử xác ựịnh gen kháng bạc lá ựã ựược xây dựng. Kỹ thuật này càng ngày càng ựược sử dụng phổ biến bởi tắnh khả thi, tắnh hiệu quả và tắnh kinh tế. Chỉ thị phân tử ựã ựược ứng dụng thành công trong việc xác ựịnh các gen kháng (Nelson và cộng sự, 1996) [43], trong việc tổ hợp nhiều gen kháng ựể tạo thành giống chứa gen kháng (Hang và cộng sự, 1997), trong chuyển gen kháng bằng phương pháp nuôi cấy mô, dung hợp tế bào trần (Kelly, 1995).
Tại Việt Nam, chỉ thị phân tử ựã ựược ứng dụng nhiều trong nghiên cứu bệnh bạc lá và chọn giống lúa kháng bệnh ở các Viện nghiên cứu, trung tâm chọn giống.
Từ năm 1997 - 2004, Viện lúa ựồng bằng sông Cửu Long ựã sử dụng phương pháp chỉ thị phân tử kết hợp với lây nhiễm nhân tạo bằng 9 race vi khuẩn phổ biến trong ựánh giá khả năng kháng bệnh của 348 giống lúa ựịa phương thu thập tại duyên hải Trung Bộ và ựồng bằng sông Cửu Long. Kết quả ựã thu ựược 17 giống mang gen Xa13, 6 giống mang gen Xa4, 4 giống mang gen xa5, 3 giống mang gen Xa7, 3 giống mang gen Xa14. Kiểm tra ựộ tin cậy của phương pháp chỉ thị phân tử trong nghiên cứu, phát hiện ở quần thể con lai giữa IR24/Barer ựối với gen xa5 cho thấy chắnh xác tới 93,3% (Bùi Chắ Bửu, Nguyễn Thị Lang, 2004 [2]. Bùi Chắ Bửu cũng ựã sử dụng chỉ thị phân tử ựể kiểm tra tổ hợp BC4F4 của IR24 với các giống lúa ựịa phương mang gen kháng Xa4, xa5, xa13 với ựộ chắnh xác cao [29].
Ở miền Bắc, chỉ thị phân tử ựã ựược ứng dụng thành công trong chọn tạo, cải tiến giống trong ựó có bạc lá và chọn giống kháng sâu, bệnh khác. Từ năm 2000 cùng với sự hợp tác của chuyên gia Nhật Bản trong khuân khổ dự án Jica, nhóm các nhà khoa học tại đại học Nông nghiệp Hà Nội ựã liên tục công bố nhiều kết quả nghiên cứu quan trọng. Nhóm nghiên cứu sử dụng chỉ thị phân tử và kỹ thuật nuôi cấy vi khuẩn ựể tiến hành thu thập, phân lập và
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 26
bảo quản chủng vi khuẩn bạc lá phổ biến ở miền Bắc. đồng thời, ựể phục vụ cho chiến lược chọn tạo giống kháng bệnh. Bằng cách lây nhiễm trên các dòng ựẳng gen các tác giả ựã kết luận ựược gen kháng hữu hiệu với các chủng ở miền Bắc Việt Nam. Cho tới nay, các gen xa5, Xa7, Xa21 ựã ựược xác ựịnh là gen kháng hầu hết các chủng vi khuẩn. Các giống lúa nhập nội từ Trung Quốc cũng ựã ựược tiến hành ựánh giá khả năng kháng bệnh, kết quả cho thấy các giống lúa nhập nội này không có khả năng kháng ựược các chủng vi khuẩn bạc lá của Việt Nam. [20].
Trong giai ựoạn 2000 - 2005, Phan Hữu Tôn và cộng sự tiến hành tìm kiếm nguồn gen kháng bạc lá từ các giống ựịa phương bằng hai phương pháp là lây nhiễm nhân tạo và PCR. Năm 2000, theo kết quả nghiên cứu ựã công bố của tác giả thì trên cơ sở ựiều tra 145 giống ựịa phương ựã phát hiện ựược 12 giống chứa gen xa5 và 2 giống chứa gen Xa7. Năm 2004, trên cơ sở tiếp tục ựiều tra 120 giống ựịa phương , Phan Hữu Tôn và cộng sự phát hiện thêm 8 giống ựịa phương chứa gen xa5. Các kết quả nghiên cứu trên ựều nhằm mục ựắch phục vụ cho chiến lược chọn giống lúa kháng bệnh bạc lá ở miền Bắc nước ta (trắch dẫn theo Trần Minh Thu [17]).
đến nay có thể khẳng ựịnh các gen Xa3, Xa4, xa5, Xa7, Xa10, Xa13,
Xa14 là các gen kháng thường có mặt trong các giống lúa ựịa phương ở Việt Nam. Các gen kháng Xa4, xa5, Xa7, Xa21 là các gen có ý nghĩa quan trọng trong việc tạo giống lúa kháng bệnh bền vững, bởi chúng có thể kháng hầu hết các chủng vi khuẩn phổ biến ở nước ta. Nhưng trong số các gen kháng hữu hiệu, tại miền Bắc thì gen Xa7 có khả năng xuất hiện nhiều hơn gen xa5. Hiện chưa có công bố nào phát hiện gen Xa21 trên các giống lúa trồng Việt Nam. Việc sử dụng kỹ thuật PCR xác ựịnh sự có mặt của gen kháng và vi khuẩn bạc lá là tương lai khả quan trong công tác chọn giống kháng ựược bệnh này.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 27