3. NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.5.2Kiểm tra khả năng mang gen kháng bệnh bạc lá bằng phương pháp PCR
Các bước tiến hành tách DNA như sau:
Bước 1: Thu ngắt mẫu lá lúa khỏe dài khoảng 2cm bỏ vào ống eppendorf có dung tắch 1.5ml, ựánh dấu tên giống rồi bỏ vào ựá lạnh.
Bước 2: Trong phòng thắ nghiệm các cối sứ ựã ựược hấp khử trùng ựặt trong ựá lạnh. Các mẫu lá ựược cắt nhỏ 0.5cm rồi bỏ vào cối sứ.
Bước 3: Nhỏ 400ộl dung dịch chiết xuất ADN vào cối rồi lấy chày nghiền nhỏ mẫu lá ựến khi dung dịch chiết xuất chuyển sang màu xanh ựen, chứng tỏ tế bào lá ựã vỡ và diệp lục ựược giải phóng ra.
Bước 4: Cho thêm 400ộl dung dịch chiết xuất ADN vào và trộn lẫn và chuyển 400ộl vào ống eppendorf ựã ựược ựánh dấu.
Bước 5: Cho vào ống eppendorf 700ộl hỗn hợp Phenol: Chlorofom: Isoamylalcohol (25:24:1). Sau ựó ly tâm 13000 vòng/phút trong 7 phút ở 4oC, rồi hút phần dung dịch phắa trên sang ống eppendorf mới ựã ựược ựánh dấu tương ứng.
Bước 6: Cho 600ộl hỗn hợp Chlorofom: Isoamylalcohol (24 : 1) lắc ựều sau ựó ly tâm 7phút với tốc ựộ 13000 vòng/phút. Sau ựó hút phần dung dịch ở trên vào ống eppendorf mới ựã ựánh dấu tương ứng.
Bước 7: Cho 800ộl Ethanol (96%) (hoặc 600ộl Isopropanol), trộn ựều sau ựó ly tâm 7 phút với tốc ựộ 13000 vòng/phút. Sau ựó ựỗ phần dung dịch phắa trên giữ lại phần kết tủa dưới ựáy ống nghiệm.
Bước 8: Rửa kết tủa bằng Ethanol 70%, làm khô tự nhiên ở nhiệt ựộ phòng bằng cách úp ngược ống nghiệm lên giấy thấm.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 41
* Phản ứng PCR
Thành phần cho phản ứng PCR
STT Thành phần Thể tắch (ộl) 1 Gotaq Colorless master mix 12.5
2 Primer F 1
3 Primer R 1
4 Free water 9.5
5 DNA template 1
Kắ hiệu, trình tự và nguồn gốc các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR
KH mồi Gen Trình tự mồi Enzyme Tác giả
Npb181 Xa4 R5
Ỗ
GTGCTATAAAAGGCATTCGGG3Ỗ
F5ỖATGGATCGATCTTCACGAGG3Ỗ - Ma Bo-Jun et al, 1999 P5 Xa7 F5
Ỗ
CAGCAATTCACTGGAGTAGTGGTT3Ỗ
R5ỖCATCACGGTCACCGCCATATCGGA3Ỗ - Porter et al.,1996 PG556 xa5 R5
Ỗ
TAGCTGCTGCCGTGCTGTGC3Ỗ
F5ỖAATATTTCAGTGTGCATCTC3Ỗ DraI Yoshimura
et al.,1995
Dẫn theo IRRI: IRRI: Planning Breeding Programs for Impact (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Thành phần 20 ộl dung dịch của phản ứng PCR gồm có: 12,24ộl nước cất, 0,1ộl Taq DNA Polymerase, 2,0ộl 10X buffer, 1,5ộl của 50 mM MgCl2, 0,16ộl của dNTPs 25mM, 1ộl mỗi mồi, 1ộl DNA nguyên bản.
- PCR của gen Xa4 và Xa7 ựược thực hiện theo chu kỳ nhiệt: 94o C trong 1 phút 560 C trong 1 phút, 720C trong 2 phút và 720C trong 8 phút.
- PCR của gen xa5 ựược thực hiện theo chu kỳ nhiệt: 94oC trong 4 phút, 34 chu kỳ 940C trong 1 phút 550C trong 1 phút, 720C trong 1 phút 50 giây và 720C trong 7 phút.
Sau ựó sản phẩm của PCR ựược cắt bằng emzyme DraI. 15ộl phản ứng gồm có 10ộl sản phẩm PCR, 0,3ộl emzyme DraI 10 unit/ộl; 1,5ộl của buffer B; 3,2ộl nước. Hỗn hợp ựược ủ ở 370C ắt nhất trong 6 giờ.
- Sản phẩm PCR ựược thực ựiện di trên gen agarose 1,5%. Bản gen ựược nhuộm bằng ethidium bromide, chụp ảnh dưới tia UV.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦẦ.. 42