2.2.1 Phương pháp nghiên cứu
Nghiên cứu hồi cứu mô tả cắt ngang kết hợp tiến cứu.
2.2.2 Thiết kế nghiên cứu
- Lựa chọn bệnh nhân theo tiêu chuẩn
- Bệnh nhân được xét nghiệm tổng phân tích máu ngoại vi, huyết tủy đồ, công thức nhiễm sắc thể, gen BCR-ABL, các xét nghiệm này được tiến hành thời điểm lần đầu vào viện và trong suốt quá trình điều trị để theo dõi đáp ứng điều trị.
- Xét nghiệm tổng phân tích tế bào máu hai tuần xét nghiệm một lần. - Xét nghiệm huyết tủy đồ và công thức nhiễm sắc thể và/ hoặc FISH mỗi 3 tháng cho đến khi đạt lui bệnh về tế bào di truyền.
- Khi xét nghiệm Ph1 và/ hoặc FISH âm tính, tiến hành làm xét nghiệm PCR định tính (Nested-RT-PCR) mỗi ba tháng cho đến khi đạt lui bệnh về mặt phân tử.
- Khi xét nghiệm PCR định tính âm tính, tiến hành làm xét nghiệm PCR định lượng (RQ-PCR).
- Lập bệnh án nghiên cứu bao gồm đầy đủ các thông tin theo mẫu riêng. - Nhận xét các mức độ đáp ứng điều trị.
2.2.3 Các bước tiến hành nghiên cứu.
- Thu thập hồ sơ bệnh án để chọn những bệnh nhân đạt lui bệnh về mức độ tế bào di truyền và phân tử ở mức xét nghiệm PCR định tính (Nested- RT-PCR) âm tính.
- Thu thập mẫu máu của bệnh nhân đủ tiêu chuẩn lui bệnh như trên để làm xét nghiệm PCR định lượng (RQ-PCR).
- Tiến hành xét nghiệm RQ- PCR xác định tỷ lệ (số lượng bản phiên mã gen BCR-ABL/G6PDH).
- Tổng kết các kết quả.
2.2.4. Vật liệu nghiên cứu
Bệnh phẩm
- Lấy 1ml máu tĩnh mạch vào ống chống đông bằng EDTA để đếm các chỉ số huyết học máu ngoại vi và làm tiêu bản máu đàn.
- Lấy 0,5ml dịch tủy vào ống chống đông bằng EDTA để đếm chỉ số huyết học và làm tiêu bản tủy đồ.
- Lấy 2-4 ml dịch tủy được hút ra từ các khoang tủy sinh máu cho vào ống chống đông Heparin Sodium 5000 UI/ml để làm công thức NST và xét nghiệm FISH.
- Lấy 2ml dịch tủy hoặc máu ngoại vi cho vào ống chống đông EDTA, tách tế bào bạch cầu, bảo quản mẫu để làm xét nghiệm RQ -PCR phát hiện đột biến gen BCR-ABL.
Phương tiện, dụng cụ nghiên cứu
- Ống Heparin Sodium (Hãng: Beaton Dickinson, Mỹ) - Chai nuôi cấy vô trùng ( 25cm2; hãng SPL Hàn Quốc) - Pipet nhựa vô trùng ( Samco Scientific, Mexico)
- Ống Falcon 15 ml ( Corning, Mỹ)
- Ống Falcon 50ml (Corning, Mỹ) - Ống tan máu
- Pipet pasteur thủy tinh - Lam kính Trung Quốc
- Hệ thống phân tích NST (Imager M1)
- Ống nghiệm Eppendorf, pipet Mann, đầu côn nhỏ. - Máy ly tâm của hãng Hitachi, Nhật.
- Máy lắc ủ nhiệt Thermomixer compact của hãng Eppendorf, Đức. - Máy Vortex.
- Máy PCR Light Cycler 2.0 của Roche.
- Máy điện di, máy chụp ảnh gel của hãng Beckman Coulter, Mỹ. - Hệ thống tìm và phân tích Metafer của hãng ZEISS.
- Phiến đá lạnh. - Quầy lạnh. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hóa chất - sinh phẩm
• Hóa chất sinh phẩm cho xét nghiệm công thức nhiễm sắc thể Ph1.
- Môi trường RPMI 1640 ( Hãng Gibco, Mỹ) - Huyết thanh bào thai bê (Hãng Gibco , Mỹ)
- Kháng sinh: Streptomicin – Penecillin (Gibco, Mỹ) - Acid acetic 5 %
- Demecolcine Solution 10µg / ml ( Sigma, Mỹ) - Dung dịch nhược trương KCL 0.075M (Ph: 7.4) - Acid acetic đậm đặc (Merk, Đức)
- Methanol tuyệt đối (Merk, Đức)
• Hóa chất sinh phẩm cho xét nghiệm FISH.
- Probe: Vysis LSI BCR-ABL Dual Cobe, Dual Fusion ( Abbott Molecular, Mỹ)
• Hóa chất - sinh phẩm để tách chiết ARN: Kít tách ARN của Qiagen, Đức.
• Hóa chất sinh phẩm cho xét nghiệm Nested-RT-PCR
- 10X Buffer - 25mM MgCl2 - 2.5mM d NTP - Cặp mồi đặc hiệu
*P190 ABL-a3-B + BCR-b1-A ABL-a3-D+ BCR-b2-C *P210 ABL-a3-B + BCR-c1-A ABL-a3-D+ BCR-c1-C
• Hóa chất - sinh phẩm để xét nghiệm RQ-PCR xác định tỷ lệ BCR- ABL/G6PDH: Sử dụng LightCycler t(9;22) Quantification Kit (hãng Roche, Mỹ)