- Vacxin nhũ dầu cúm gia cầm chủng NIBRG14 do Viện Công nghệ sinh họcthuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam sản xuất
3. đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.4 Phát hiện virus cúm gia cầm:
Sử dụng phản ứng Real-time RT-PCR (RRT-PCR).
* Phương pháp làm phản ứng RRT-PCR
Mẫu ARN ựược chiết tách từ bệnh phẩm ựược sử dụng làm phản ứng RRT- PCR ựể phát hiện virus. Dùng kắt chiết tách Qiagen Rneasy minikit. Cần có một khu vực "sạch" tách biệt với khu vực chiết tách mẫu ựể thực hiện việc pha hỗn hợp phản ứng (master mix).
Có thể sử dụng các cặp primer ựặc hiệu ựể phát hiện gen M (cúm type A), gen H5 và gen N1. Primer phát hiện các loại H và N khác cũng dùng tương tự.
Master mix ựược tắnh toán và pha ựủ dùng cho số lượng mẫu cần kiểm tra, sau ựó chia vào các ống PCR, lượng 20 ộl/ống. Lúc này mới tiến hành nhỏ 5 ộl mẫu ARN vào từng ống. Mỗi test ựều cần có ựầy ựủ ựối chứng dương và ựối chứng âm. Cho 5 ộl ARN ựối chứng dương vào ống ựối chứng dương, 5 ộl nước sạch RNase vào ống ựối chứng âm.
- Tiến hành phản ứng:
đặt ống phản ứng vào máy chu kỳ nhiệt và chọn chương trình chạy PCR bằng phần mềm trên máy vi tắnh. Nhập ký hiệu mẫu kiểm tra cùng với mẫu ựối
chứng dương tắnh, âm tắnh vào phần Ký hiệu mẫu trong bảng kết quả. Lưu chương trình chạy máỵ Cài ựặt chương trình phân tắch dữ liệu cho máy chu kỳ nhiệt (vắ dụ máy Cepheid Smart Cycler hoặc Biorad IQ5) và chạy chương trình.
- Phân tắch kết quả xét nghiệm:
Các giá trị mặc ựịnh ựã ựược thiết lập trong chương trình chạy của máy RRT-PCR ựể phát hiện gen của virus (tương ứng với primer). Mẫu ựối chứng dương tắnh (ựược chuẩn ựộ trước) phải có giá trị Ct như ựã biết và mẫu ựối chứng âm tắnh phải có Ct = 0 thì kết quả RRT-PCR mới ựược công nhận.
+ Mẫu có giá trị Ct ≤ 35 ựược coi là dương tắnh. Giá trị Ct càng thấp thì lượng ARN của virus trong mẫu chiết tách càng caọ
+ Mẫu không có Ct ựược coi là âm tắnh.
+ Mẫu có giá trị Ct trong khoảng 35 - 40 ựược coi là nghi ngờ. đối với mẫu chẩn ựoán, nếu kết quả RRT-PCR nghi ngờ, cần ựược xác chẩn bằng phương pháp phân lập virus (trên trứng có phôi, trên tế bào) trước khi ựưa ra kết luận cuối cùng.