- Vacxin nhũ dầu cúm gia cầm chủng NIBRG14 do Viện Công nghệ sinh họcthuộc Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam sản xuất
3. đỐI TƯỢNG, đỊA đIỂM, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.3 Phương pháp làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
Trong bệnh cúm gia cầm, phản ứng HI thường ựược sử dụng ựể: - Giám ựịnh subtype virus cúm gia cầm phân lập ựược.
- Phát hiện kháng thể cúm gia cầm.
Trước khi làm phản ứng HI, phảỉ làm phản ứng ngưng kết hồng cầu (phản ứng HA) ựể xác ựịnh ựơn vị HA dùng cho phản ứng HỊ
* Phương pháp làm phản ứng HA
- Nguyên liệu:
+ Kháng nguyên chuẩn virus cúm H5N1. + Hồng cầu gà 1%.
+ Dung dịch PBS 0,01M. - Cách tiến hành:
+ Nhỏ 25 ộl dung dịch PBS 0,01M vào ựĩa vi chuẩn ựộ Microtitler 96 giếng chữ V từ giếng thứ 1 ựến giếng 12 của mỗi hàng.
+ Cho 25 ộl kháng nguyên vào giếng thứ 1, trộn ựềụ
+ Pha loãng kháng nguyên theo cơ số 2 bằng cách chuyển 25 ộl từ giếng thứ 1 sang giếng thứ 2 và tuần tự ựến giếng 11 thì bỏ ựi 25 ộl (giếng 12 làm ựối chứng chỉ có dung dịch PBS).
+ Nhỏ thêm 25 ộl dung dịch PBS vào các giếng. + Nhỏ 25 ộl hồng cầu gà 1% vào tất cả các giếng trên. + Lắc ựĩa bằng máy hoặc bằng taỵ
+ Ủ ựĩa phản ứng ở nhiệt ựộ phòng, thời gian khoảng 30 phút. - đánh giá kết quả:
+ Phản ứng dương tắnh: hồng cầu ngưng kết rải ựều ở ựáy giếng.
Hiệu giá phản ứng HA: ựược tắnh ở ựộ pha loãng kháng nguyên cao nhất còn hiện tượng ngưng kết hồng cầụ
Vắ dụ: độ pha loãng 1/128 còn có ngưng kết thì hiệu giá HA là 1/128. + Phản ứng âm tắnh: hồng cầu lắng xuống ựáy thành cục tròn ựỏ, phần dung dịch phắa trên trong như giếng ựối chứng âm.
* Pha kháng nguyên chuẩn 4 HA:
Lấy ựộ pha loãng cuối cùng có phản ứng ngưng kết hồng cầu chia cho 4. Vắ dụ: Hiệu giá HA của kháng nguyên là 1/128, ựơn vị 4 HA = 128 : 4 = 32.
Như vậy sẽ trộn 1 phần kháng nguyên với 31 phần dung dịch PBS ựể ựạt ựược dung dịch kháng nguyên 4 HẠ
Sau khi pha, kháng nguyên 4 HA phải ựược chuẩn ựộ lạị
Tiến hành: Như phản ứng HA nhưng chỉ cần thực hiện 4 giếng ựầu (giếng thứ 4 làm ựối chứng).
- Pha chuẩn: Kết quả ngưng kết xảy ra ở 2 giếng ựầụ - Pha không chuẩn:
Kháng nguyên ựặc: nếu ngưng kết ựến giếng thứ 3 tức là thừa kháng nguyên. Như vậy, kháng nguyên phải ựược pha loãng 8 HA (có thể gấp ựôi) ựể có ngưng kết ựến giếng thứ 2.
Kháng nguyên loãng: nếu chỉ ngưng kết giếng thứ 1 tức là thiếu kháng nguyên, có thể thêm một lượng kháng nguyên (bằng với lượng kháng nguyên pha ban ựầu) ựể có ngưng kết ựến giếng thứ 2.
* Phương pháp làm phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI)
- Nguyên liệu:
+ Kháng nguyên chuẩn virus H5N1: dùng cho phản ứng HI là 4 ựơn vị HẠ + Huyết thanh gia cầm cần kiểm trạ
+ Hỗn dịch hồng cầu gà 1%. + Dung dịch PBS.
- Tiến hành phản ứng HI
+ Dùng ựĩa ngưng kết Microtitler 96 giếng, ựáy chữ V (hoặc U). Nhỏ 25 ộl dung dịch PBS vào mỗi giếng, từ giếng 1 ựến giếng 12.
+ Nhỏ 25 ộl huyết thanh gia cầm cần kiểm tra vào giếng thứ 1 trộn ựều rồi pha loãng theo cơ số 2 bằng cách chuyển 25 ộl từ giếng 1 sang giếng 2, cứ thế tuần tự ựến giếng 11 thì hút bỏ 25 ộl.
+ Nhỏ 25 ộl kháng nguyên chuẩn ựã ựược pha loãng bằng 4 HA vào các giếng từ 1 - 11. Giếng thứ 12 cho 25 ộl dung dịch PBS làm ựối chứng.
+ Nhỏ hồng cầu 1% vào tất cả các giếng. Lắc nhẹ và ủ tiếp ở nhiệt ựộ phòng trong 40 phút.
- đánh giá kết quả:
+ Phản ứng HI dương tắnh khi có hiện tượng ức chế ngưng kết hồng cầụ Hồng cầu lắng xuống ựáy giếng thành chấm tròn.
Hiệu giá của phản ứng HI là ựộ pha loãng huyết thanh cao nhất mà ở ựó vẫn còn kháng thể có khả năng ức chế ngưng kết hồng cầụ
+ Phản ứng HI âm tắnh: hồng cầu ngưng kết nằm rải rác thành mảng dưới ựáy giếng.
Phản ứng HI dương tắnh chứng tỏ có sự kết hợp ựặc hiệu của kháng thể sinh ra do vacxin với kháng nguyên chuẩn ựã biết.