- Các loại tủ lạnh: 200 C, 800 C, 40C Buồng an toàn sinh học cấp độ
3.5.3. Nguyên lý phản ứng Real Time PCR (RT – PCR)
Phản ứng RT – PCR là một kỹ thuật PCR sử dụng các đặc điểm của quá trình sao chép ADN. Trong phản ứng PCR truyền thống, sản phẩm khuếch đại được phát hiện qua phân tích điểm kết thúc bằng cách điện di ADN trên gen agarose khi phản ứng kết thúc. Ngược lại, RT – PCR cho phép phát hiện và định lượng sự tích lũy ADN khuếch đại ngay khi phản ứng đang xảy ra. Khả năng này được phát hiện nhờ bổ sung vào phản ứng những phân tử phát quang. Những hóa chất phát huỳnh quang bao gồm thuốc nhuộm liên kết ADN và những trình tự gắn huỳnh quang liên kết đặc hiệu với primer gọi là probe. Khi ADN tương hợp với primer thì quá trình sao chép sẽ xảy ra và sự gia tăng lượng tín hiệu huỳnh quang tỉ lệ với sự gia tăng lượng ADN. Khi sử dụng máy Bio – Rad, máy có bộ phận camera có thể chụp được tín hiệu huỳnh quang khi quá trình khuếch đại xảy ra. Ban đầu, tín hiệu huỳnh quang còn ở tín hiệu nền ta không thể phát hiện sự gia tăng tín hiệu cho dù có quá trình khuếch đại và sản phẩm đã tăng theo hàm mũ. Đến một thời điểm xác định, sản phẩm khuếch đại đã tạo ra đủ tín hiệu huỳnh quang có thể phát hiện được. Chu kỳ này được gọi là chu kỳ ngưỡng Ct (Cycle of threshold). Đây cũng là giá trị để đánh giá kết quả phản ứng.
Cúm gia cầm type A có vật chất di truyền là ARN nên trong phản ứng real time PCR có thêm quá trình sao chép ngược từ ARN thành ADN gọi là Reverse transcription nên phương pháp này được gọi là real time RT – PCR.
* Nguyên lý hoạt động của probe:
Có nhiều loại hóa chất phát huỳnh quang dựa trên primer và probe, hóa chất được sử dụng trong phản ứng real time RT - PCR là Taqman probe.
Taqman probe được sử dụng như một trình tự Oligonucleotide đặc hiệu, gắn chất huỳnh quang gọi là mẫu dò Taqman probe, cùng với các primer.
Taqman probe gắn một chất phát huỳnh quang ở đầu 5’ và một chất hấp phụ huỳnh quang ở đầu 3’. Khi còn nguyên vẹn, tín hiệu của chất phát huỳnh quang bị hấp thụ do nó nằm gần chất hấp phụ. Trong giai đoạn kết hợp bắt gặp và kéo dài ADN trong phản ứng khuếch đại, probe liên kết với trình tự đích và hoạt động 5’ – 3’ exonuclease đặc hiệu cho ADN mạch đôi của Taqman probe sẽ cắt đứt đầu gắn chất huỳnh quang. Kết quả chất huỳnh quang bị tách khỏi chất hấp phụ và tín hiệu huỳnh quang phát ra tỉ lệ với lượng sản phẩm khuếch đại trong mẫu.
Hình 3.1. Cơ chế hoạt động của Taqman probe