Kết quả lấy mẫu fucoidan để chạy phổ cộng hưởng từ hạt nhân tại Viện Hóa học – Viện Khoa Học Việt Nam thể hiện ở hình 3.5.
Hình 3.5. Phổ HNMR của fucoidan thô được đo tại viện Hóa học
Phổ 1H-NMR (500 MHz) và 13C-NMR (125 MHz) đo trên máy Bruker AVANCE 500 tại Viện Hóa học. Tetrametylsilan (TMS) (cho 1H) hoặc tín hiệu dung môi (cho 13C) được dùng làm nội chuẩn. Các mẫu fucoidan được đo với D2O/0.1% CF3COOD. Đây là phổ HNMR của fucoidan thô chưa phân đoạn nên các pic không sắc nét lắm tuy nhiên các tín hiệu phổ ở vị trí 1.0-1.5ppm và 5.0-
5.5ppm chứng tỏ sự có mặt của fucosyl trong polysaccharide, chứng tỏ sản phẩm là fucoidan.
Hình 3.6. Phổ HNMR của fucoidan thô được đo tại Viện Sinh hóa Thái Bình Dương-Vladivostok - Viện Hàn lâm Nga
So sánh với HNMR của fucoidan tách chiết từ rong nâu Sargassum denticarpum được đo và xác định tại Viện Sinh hóa Thái Bình Dương-Vladivostok
- Viện Hàn lâm Nga (báo cáo tổng kết đề tài “Nghiên cứu qui trình và thiết bị sản xuất fucoidan từ rong nâu Việt Nam qui mô pilot” của Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang, cho thấy mặc dù độ lớn các pic tín hiệu khác nhau nhưng phân bố các pic cho thấy các tín hiệu chủ yếu 1.0-1.5ppm và 5.0-5.5ppm của 2 phổ HNMR là tương đồng. Như vậy Chúng tôi đã tách chiết được sản phẩm fucoidan từ rong nâu Sargassum polycystum.
3.6. ĐỀ XUẤT QUY TRÌNH SẢN XUẤT FUCOIDAN:
KOH, H2O2 CaCl2 Alginate, bã rong Các chất rắn lơ lửng Các ion dương EtOH (900) Laminaran Dịch/cồn = 1/2
Hình 3.7. Sơ đồ quy trình thu nhận fucoidan từ rong nâu Sargassum polycystum
Thuyết minh quy trình:
Bột rong: rong nguyên liệu sau khi xử lý thì xay thành bột, bao gói kín tránh hút ẩm và mốc để sử dụng cho việc tách chiết thu nhận fucoidan.
Loại acid Alginic
Lọc qua vải Lọc cát và than hoạt tính Lọc qua cột nhựa Nấu (700C, 45 phút) Kết tủa Tách kết tủa Hút chân không Sấy kết tủa Fucoidan Bột rong khô
Nấu: đây là công đoạn quan trọng nhằm thu được fucoidan. Nấu rong trong môi trường KOH và có mặt của H2O2, ở nhiệt độ 700C trong vòng 45 phút. Hydropeoxit trong môi trường kiềm oxi hóa rất mạnh polyphenol làm sản phẩm có màu sáng. Đồng thời toàn bộ các độc chất không mong muốn ví dụ thuốc bảo vệ thực vật, vi khuẩn, mấm mốc... sẽ bị phá hủy. Khi nấu nên tiến hành khuấy đảo để tăng quá trình trao đổi nhiệt đồng thời giảm lượng bột trào lên.
Loại alginate: Có một tính chất quan trọng của Alginate là có khả năng tạo kết tủa với Ca++ (kể cả canxi photphat, canxi clrua, canxi cacbonat, canxi xitrat). Vì vậy mục đích của việc thêm CaCl2 vào dịch rong trong khi nấu là để tạo ra kết tủa Alginate canxi do phản ứng giữa Alginate trong rong và canxi clorua cho vào. Hơn nữa, đặc tính của alginate là kết tủa mạnh trong môi trường acid (pH=2) hoặc kết hợp với ion calcium kết tủa mạnh trong môi trường trung tính, kết tủa AlgCa (alginate calcium) sẽ kết chặt với bã rong thành khối bền vững và tách hẳn khỏi nước, dịch chiết còn lại sẽ rất trong, polysaccharide chỉ còn fucoidan và laminaran.
Lọc vải: Sau khi đã tiến hành tủa Alginate thì cần lọc qua vải để loại bỏ kết tủa và bã rong. Để thúc đẩy quá trình này diễn ra nhanh hơn thì có thể vắt dịch rong. Lọc qua cát và than hoạt tính: do lúc này trong dịch rong vẫn còn rất nhiều các chất rắn nằm lư lửng trong nó mà lọc vải chưa lọc hết được nên phải lọc qua cát và than hoạt tính để loại chúng ra khỏi dịch rong. Chúng sẽ giữ lại trên bề mặt chúng các hợp chất đó và được loại bỏ chúng ra ngoài, còn dịch lọc được thu lại và đi qua công đoạn tiếp theo.
Lọc qua cột nhựa trao đổi ion: tại đây các ion dương, đặc biệt là ion canxi dư lại trong dịch rong sẽ được các hạt nhựa này giữ lại bởi các hạt nhựa này là các ion âm, chúng sẽ hút và giữ lại trên bề mặt chúng các ion dương. Đến một lúc nào đó các hạt nhựa sẽ bị no (bão hòa), lúc này quá trình lọc sẽ không có hiệu quả. Vì vậy cần theo dõi thường xuyên quá trình lọc và thử xem hạt nhựa đã no hay chưa để rửa giải chúng. Khi hạt nhựa đã bão hòa thì pH của dịch chiết sau khi lọc qua cột nhựa sẽ thay đổi. Nếu như pH dịch chiết vẫn bằng 7 (trung tính) thì có nghĩa là không có sự trao đổi ion trong dịch chiết và hạt nhựa nữa hay nói cách khác hạt nhựa đã bị
no. Khi đó phải tiến hành rửa hạt nhựa bằng acid HCl, khi cho HCl vào thì sẽ tạo muối CaCl2 hoặc muối NaCl … Các muối này sẽ theo dòng chảy của dung dịch acid chảy ra ngoài.
Kết tủa: Như đã biết cồn là một dung môi phân cực háo nước nên sử dụng chúng để kết tủa Fucoidan. Trong dịch chiết lúc này còn chứa một phần Laminaran chưa bị loại bỏ ra. Mà tính chất của Laminaran là kết tủa trong cồn đến nồng độ 85% trở lên (tức là sau khi tủa nồng độ cồn là 85%). Tiến hành cho cồn 900 với thể tích gấp 2 lần so với dịch rong vào dịch rong để kết tủa, quấy mạnh tay để quá trình kết tủa xảy ra nhanh hơn. Kết tủa có màu nâu, kết bông lớn, lắng xuống đáy.
Tách kết tủa: Sau khi thu được kết tủa thì để một thời gian cho kết tủa lắng xuống đáy, sau đó gạn lớp cồn phía trên đi (có thể dùng để chưng cất thu cồn cao độ), còn kết tủa thì được thu lại và tiến hành hút chân không ở công đoạn sau.
Hút chân không: Dùng máy hút chân không để hút cồn và nước còn sót lại trong kết tủa. Lúc này kết tủa sẽ khô hơn tuy nhiên vẫn còn rất ẩm. Công đoạn hút chân không này nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sấy kết tủa sau.
Sấy kết tủa: Tiến hành sấy kết tủa trong tủ sấy ở nhiệt độ 500C và trong thời gian 18 giờ, sấy đến khối lượng không đổi thì kết thúc. Thường khi khô thì cứng, không ẩm khi đặt tay vào. Quá trình sấy kết thúc, thu được sản phẩm fucoidan.
KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN
1. KẾT LUẬN:
Từ kết quả nghiên cứu ở trên cho phép rút ra một số kết luận sau:
1) Phương pháp thu nhận fucoidan từ rong nâu Sargassum polycystum cho hàm lượng fucoidan cao nhất 3.05g / 150g mẫu rong bột khô là phương pháp tách chiết fucoidan mà đồ án lựa chọn.
2) Nhiệt độ thích hợp cho quá trình nấu rong thu nhận fucoidan là 700C. 3) Thời gian thích hợp cho quá trình nấu rong thu nhận fucoidan là 45 phút. 4) Tỉ lệ cồn thích hợp bổ sung vào để kết tủa thu nhận fucoidan là cồn / dịch =
2/1.
5) Đã đề xuất quy trình tách chiết fucoidan từ rong nâu Sargassum polycystum.
2. ĐỀ XUẤT Ý KIẾN:
Từ các nghiên cứu ở trên cho phép đề xuất ý kiến là nên tiếp tục nghiên cứu để đưa ra một quy trình hoàn thiện hơn ở quy mô công nghiệp để có thể sản xuất fucoidan trên quy mô lớn từ đó ứng dụng trong sản xuất thực phẩm như điều trị ung thư, HIV, các bệnh về tim mạch...
Đề tài này chỉ mới nghiên cứu hoàn thiện quy trình tách chiết fucoidan từ rong Sargassum polycystum thu được hiệu suất cao nhất nhưng chưa nghiên cứu đưa ra các hoạt tính sinh học của fucoidan đã tách chiết, vì vậy nên tiếp tục nghiên cứu để hoàn thiện hơn.
Để được thị trường chấp nhận thì ngoài việc tách chiết ra Fucoidan và nghiên cứu hoạt tính sinh học thì cần phải nghiên cứu đóng gói trong bao bì, nhãn mác… thành một sản phẩm thực thụ có thể xuất hiện và tồn tại trên thị trường.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tiếng Việt:
1. Nguyễn Duy Nhứt (2008), Nghiên cứu thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của polysaarit trong một số loài rong nâu ở tỉnh Khánh Hòa, tài liệu lưu hành nội bộ, Viện Nghiên cứu và Ứng dụng Công nghệ Nha Trang.
2. Nguyễn Hữu Đại (1997), Rong mơ (Sargassaceae) Việt Nam nguồn lợi và sử dụng, Nhà xuất bản Nông Nghiệp, Hà Nội.
3. Trần Đình Toại, Châu Văn Minh (2005), Rong biển dược liệu Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa học và Kỹ thuật.
4. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn, Ngô Đăng Nghĩa (2004), Chế biến rong biển, Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội.
5. Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Năm (2007), Fucoidan – polysaccharide chiết từ rong nâu, sản phẩm có hoạt tính sinh học cao, “ứng dụng trong y học và nuôi trồng thủy sản”, tạp chí khoa học và công nghệ, tập 45, số 1, trang 39 - 46. Tiếng Anh:
6. Colliec, S. et al. (1991), "Anticoagulant Properties of a Fucoidan Fraction" Thromb Responsibilities : 64(2):143-54
7. Dararad Choosawad, Ureporn Leggat, Chavaboon Dechsukhum, Amornrat Phongdara and Wilaiwan, (2005), ChotigeatAnti-tumour activities of fucoidan from the aquatic plant Utricularia aurea lour Songklanakarin J. Sci. Technol., Dec. 27(Suppl. 3) : 799-807.
8. Investment Promotion Agency of Administrative Committee of Yantai Economic & Technological Development Area, August 3, 2007, http://www.yantaiinvest.gov.cn/htm_eng/project_auto_1.htm.
9. Itoh, Hiroko; Noda, Hiroyuki; Amano, Hideomi; Zhuaug, Cun; Mizuno, Takashi; Ito, Hitosh (1993), Antitumor activity and immunological properties of marine algal polysaccharides, especially fucoidan, prepared from Sargassum thunbergii of Phaeophyceae. i. Anticancer Res. 13(6A):2045-52
10. Kobayashi T, Honke K, Miyazaki T, Matsumoto K, Nakamura T, Ishizuka I, Makita A. 1994. Hepatocyte growth factor (HGF) specifically binds to sulfoglycolipids. J.Biol chem Apr 1;269(13):9817-21.
11. Koyanagi S.; Tanigawa N.; Nakagawa H.; Soeda S.; Shimeno H.(2003). Oversulfation of fucoidan enhances its anti-angigogenic and antitumor activities biochemical pharmacology 65173-179
12. Lionel Chevolot , Alain Foucault , Frederic Chaubet , Nelly Kervarec , Corinne Sinquin, Anne-Marie Fisher, Catherine Boisson-Vidal. (1999), Further data on the structure of brown seaweed fucans: relationships with anticoagulant activity Carbohydrate Research 319 154–165
13. Maria I. Bilan, Alexey A. Grachev, Alexander S. Shashkov, Nikolay E, Nifantiev and Anatolii I. Usov(2004), A highly regular fraction of a fucoidan from the brown seaweed Fucus distichus L Carbohydrate Research 339 511-
517
14. Maruyama, Hiroko) (2003),Tamauchi, Hidekazu; Hashimoto, Minoru; Nakano, Takahisa. Antitumor activity and immune response of Mekabu fucoidan extracted from Sporophyll of Undaria pinnatifida. In Vivo 17(3), 245-249. 15. Pearce - Pratt R, et al. (1996). "Sulfated polysaccharides inhibit lymphocyte -
to - epithelial transmission of human immunodeficiency virus - 1" Biological Reproduction : 54:173-82.
16. Public Heath service Food and drug Administration Washington DC November 14,2000
17. Rita Elkins M.H.,.(2001). Limu Moui – prize sea plant of tonga and the south pacific. Woodland Publishing - Utah – USA 32 pagine (ed. 2001)
18. Shibata, Hideyuki; Iimuro, Masaki; Uchiya, Naoaki; Kawamori, Toshihiko; Nagaoka, Masato; Ueyama, Sadao; Hashimoto, Shusuke; Yokokura, Teruo; Sugimura, Takashi; Wakabayashi, Keiji. (2003). Preventive effects of Cladosiphon fucoidan against Helicobacter pylori infection in Mongolian gerbils. Cancer Prevention Division, National Cancer Center Research Institute, Chuo-ku, Tokyo, Japan. Helicobacter 8(1), 59-65
19. Teas J., Pino S., Critchley A., Braverman L. E., Thyroid, (2004) Variability of iodine content in common commercially available edible seaweeds. Vol.14, No. 10, p. 836-841 .
20. W.A.P.Black,1952...Laboratory - Scale Isolation of Fucoidin from Brown Marine Algae J.Sci.Fd.Agric, 1952, 3, 122.
21. Vaugelade, P. et al. 2000. "Non - strarch polysaccharides extracted from seaweed can modulate intestinal absorption of glucose and insulin response in the pig" Reproductive and Nutritional Development (Jan - Feb): 40 (1): 33-47 22. Verdrengh M. Erlandsson-Harris H. Tarkowski A. 2000. Role of selectins in
experimental Staphylococcus aureus-induced arthritis. European Journal of Immunology. 30(6):1606-13, Jun.
Tài liệu Internet:
23. http://devi-renewable.com/2012/03/05/potential-of-seaweed-for-ethanol production-in-vietnam/ 24. http://nongnghiep.vn/nongnghiepvn/72/5/5/58007/Rong-bien-Can-khai-thac che-bien-hop-ly.aspx 25. http://sonongnghiep.bentre.gov.vn/qlcl-a-vsattp/vsattp/711-rong-bin-co-th-ci thin-c-cht-lng-va-an-toan-thc-phm.html
PHỤ LỤC
PHỤ LỤC 1.1 PHÂN BỐ CỦA BA NHÓM RONG BIỂN TRÊN THẾ GIỚI
1. Chlorophyta
Acetabularia major M Indonesia Philippines
Capspsilhon fulvescens F Korea
Caulerpa spp. F Malaysia, Thailand
Caulerpa lentillifera F, M Philippines
Caulerpa peltata F, M Philippines
Caulerpa racemosa F Bangladesh, Japan,, Philippines, South, Pacific Islands, Vietnam
M Philippines
Caulerpa sertularioides F, M Philippines
Caulerpa taxifolia F, M Philippines
Codium spp. F Argentina
Codium bartletti F Philippines
Codium edula F Philippines
Codium fragile F Korea, Philippines
Codium muelleri F Hawaii
Codium taylori F Israel
Codium tenue F Indonesia
Codium tomentosum F Indonesia
Colpomenia sinuosa F Philippines
Dictyosphaeria cavernosa Ag Kenyza M Philippines
Enteromorpha spp. Ag Portugal
F Bangladesh, France, Hawaii, Myanmar
Enteromorpha compressa F Korea, Indonesia M Indonesia, Philippines
Enteromorpha clathrata F Korea
Enteromorpha grevillei F Korea
Enteromorpha intestinalis F Indonesia, Japan, Korea M Indonesia
Enteromorpha linza F Korea
Enteromorpha nitidum F Korea
Enteromorpha prolifera F Indonesia, Japan, Korea, Philippines M Indonesia
Monostroma nitidum F Japan
Scytosiphon lomentaria F Korea, France
Ulva spp. Ag Italy, Portugal
F Argentina, Canada, Chile, Hawaii, Japan, Malaysia
P Italy
Ulva lactuca F Vietnam, Indonesia
Ulva pertusa M Philippines
Ulva reticulata F Vietnam 2. Rhodophyta
Acanthophora spicifera C Vietnam
F Philippines, Vietnam
Ahnfeltia plicata Ag Chile (Ag)
Asparagopsis taxiformis F Hawaii, Indonesia M Philippines
Beataphycus gelatinum F, C Vietnam
Calagossa adnata F Indonesia
Calagossa leprieurii M Indonesia, Vietnam
Catenella spp. F Myanmar
Chondria crassicaulis F Korea
Chondus crispus C France, Spain, US F Ireland, France
Chondus ocellatus F Japan
Eucheuma alvarezii C Malaysia, Kiribati
Eucheuma cartilagineum F Japan
Eucheuma denticulatum C Philippines, Madagascar
Eucheuma gelatinae C China, Indonesia, Philippines F Indonesia, Japan, Philippines
Eucheuma isiforme F Caribbean
Eucheuma muricatum F, M Indonesia
Eucheuma striatum C Madagascar
Geldiella acerosa A India, Malaysia, Vietnam F Philippines
Geldiella tenuissima F Bangladesh
Geldiella spp. A China, Japan F Hawaii
Geldiella abbottiorum A South Africa
Geldiella anansii F, M Korea, Indonesia
Geldiella capense A South Africa
Geldiella chilense A Chile
Geldiella latifolium A Spain F Indonesia
Geldiella ligulatum A Chile
Geldiella madagascariense A Masagascar
Geldiella pristoides A South Africa
Geldiella pteridifolium A South Africa
Geldiella robustum A Mexico
Geldiella rex A Chile
Geldiella sesquipedale A Morocco, Potugal, Spain
Geldiella vagum A Canada
Gigartina canaliculata C Mexico
Gigartina chamissoi C Peru C Chile
Gigartina intermedia C Vietnam
Gigartina scottsbergii C Argentina, Chile
Gloiopeltis spp. F Vietnam
Gloiopeltis furcata F Korea C Japan
Gloiopeltis tenax C Japan F Korea
Gloiopeltis complanata C Japan
Gracilaria spp. Ag Portugal C Malaysia
F Myanmar, Thailand P Italia
M Vietnam
Gracilaria asisatica A China, Vietnam F Vietnam
Gracilaria bursa-pastoris F Japan
Gracilaria caudate A Brazil
Gracilaria changii F Thailand
Gracilaria chilensis A Chile
Ag New Zealand
Gracilaria cornea A Brazil F Caribbean
Gracilaria coronopifera F Hawaii, Vietnam
Gracilaria crassissima F Caribbean
Gracilaria domingensis F Brazil, Caribbiean, Chile
Gracilaria edulis A India
Gracilaria eucheumoides F Indonesia, Vietnam M Indonesia
Gracilaria firma A Philippines, Vietnam C Philippines
F Vietnam
Gracilaria fisheri A, F Thailand
Gracilaria folifera A India
Gracilaria gracilis A Namibia, south Africa
F Vietnam
Gracilaria howei A Peru
Gracilaria lemaneiformis A Mexico, Peru F Japan
Gracilaria longa A Italy
Gracilaria pacifica A Canada
Gracilaria parvispora F Hawaii
Gracilaria salicornia A Thailand
F Thailand, Vietnam
Gracilaria tenuistipitata var. liui.
A China, Philippines, Thailand, Vietnam
F Thailand, Vietnam
Gracilaria verrucosa A Argentina, Egypt, Italy
F France, Indonesia, Japan, korea M Indonesia
Gracilariopsis lemaneiformis A Canada
Gracilariopsis tenuifrons A Brazil
Grateloupia filicina F Indonesia, Japan
Gymnogongrus furcellatus C Chile
Halymenia spp. F Myanmar
Halymenia discoidea F Bangladesh
Halymenia durvillaei F Philippines
Halymenia venusta Ag Kenya
Hypnea spp. F Myanmar
Hypnea musciformis C Brazil
Hypnea muscoides C, F Vietnam
Hypnea nidifica F Hawaii
Hypnea pannosa F Bangladesh, Philippines
Hypnea valentiae C, F Vietnam
Iridaea ciliate C Chile
Iridaea edulis F Iceland
Iridaea laminarioides C Chile
Iridaea membrenacea C Chile
Kappaphycus alvarezii C Philippines, Tanzania F Philippines
Kappaphycus cottonii C, F, M
Vietnam
Laurencia obtusa F, M Indonesia
Laurencia papillosa Ag Kenya, Philippines
Laurencia pinnitifida F Portugal
Liththamnion corallioides Ag France, Ireland, UK
Mastocarpus stellatus C Portugal, Spain F Ireland
Mazzaella splendens A, F Canada
Meristotheca papulosa F Japan
Meristotheca procumbens F South Pacific Islands
Nemalion vericulare F Korea
Palmaria hecatensis F Canada
Palmaria mollis F Canada
Palmaria palmate F Canada, France, Iceland, Ireland, UK, US
Phymatolithon calcareum Ag France, Ireland, UK
Porphyra spp. F Israel, New Zealand, UK
Porphyra abbottae F Alaska, Canada
Porphyra acanthophora F Brazil
Porphyra atropurpurae F, M Indonesia
Porphyra columbina F Argentina, Chile, Pure
Porphyra crispate F Thailand, Vietnam
Porphyra fallax F Canada
Porphyra haitanensis F China
Porphyra kuniedae F Korea
Porphyra leucostica F Portugal
Porphyra perforate F Canada
Porphyra psuedolanceolata F Canada
Porphyra seriata F Korea
Porphyra spiralis F Brazil
Porphyra suborbiculata F Korea, Vietnam
Porphyra tenera F Japan, Korea
Porphyra torta F Alaska, Canada
Porphyra umbilicalis F France, US
Porphyra vietnamensis F Thailand