Trên thế giới đã có nhiều công bố về việc chiết tách fucoidan từ rong nâu từ rất lâu vào những năm 1880 đến nay. Tiến hành tách chiết fucoian theo 3 phương pháp tách chiết khác nhau đã công bố trên thế giới và đưa ra hướng tách chiết fucoidan dự kiến. Từ đó đánh giá hàm lượng fucoidan thu được và lựa chọn ra một phương pháp tách chiết thích hợp. Sử dụng EtOH với nồng độ thích hợp để tách fucoidan ra khỏi dịch rong.
Phương pháp chiết fucoidan của bản quyền US6573250B2:
Hình 2.2. Sơ đồ chiết fucoidan theo bản quyền US6573250B2.
Do thiết bị chiết rắn lỏng Westfalier và thiết bị lọc rây phân tử không có để thực hiện thí nghiệm nên trong thí nghiệm này chúng tôi không sử dụng hai thiết bị này mà thay và đó là thiết bị lọc cát và than hoạt tính và thiết bị lọc trao đổi ion để
Rong khô: 20kg CaCl2.2H20: 7.3 kg
Nước máy: 900 lit
Thổi hơi nóng (21 – 900C) vào trong 40 phút Giữ 90 – 950C trong 1 giờ
Làm nguội
Lọc rây phân tử với màng 30kDa, chạy đến khi còn 20 lit, thêm nước thành 100 lit, chạy đến còn 25 lit,
lặp lại 3 lần.
1kg sản phẩm khô
(65% fucoidan và 33% U-fucoidan) Chiết rắn lỏng trên thiết bị chiết Westfalier
làm thí nghiệm. Dựa theo bản quyền US6573250B2 về phương pháp chiết fucoidan tôi tiến hành thí nghiệm như sau:
Cân 50g rong khô đã xay thành bột cho vào cốc thủy tinh hoặc bình tam giác chịu nhiệt. Dùng ống đong đong đúng 2250 ml nước máy cho vào hòa trộn với bột rong. Sau đó cho 13.75g CaCl2 vào hỗn hợp trên. Tiến hành thổi hơi nóng vào mẫu với nhiệt độ là 21 - 900C trong vòng 40 phút bằng cách bỏ mẫu vào bể ổn nhiệt. Sau 40 phút tiến hành giữ mẫu ở nhiệt độ 900C trong thời gian là 1 giờ, sau đó làm nguội mẫu. Sau khi mẫu đã nguội thì tiến hành lọc vải (lọc thô) để loại bỏ kết tủa alginate và bã rong. Kết tủa alginate-canxium sinh ra do alginate trong rong kết hợp với ion Ca++ trong CaCl2.
Lúc này trong dịch rong vẫn còn tồn tại các tạp chất rắn lơ lửng mà lọc vải chưa loại bỏ hết được nên cần phải loại bỏ chúng ra khỏi dịch rong bằng cách lọc dịch qua cột cát và than hoạt tính. Sau đó cho dịch rong thu được chạy qua cột nhựa trao đổi ion để loại bỏ ion dương trong dịch rong như Ca2+, Na2+…
Dịch thu được sau đó được tủa bằng cồn 900 để thu fucoidan với tỉ lệ cồn cho vào là cồn: dịch rong bằng 2:1.
Để 1 thời gian cho kết tủa lắng xuống hết, gạn bỏ lớp cồn phía trên, lớp cồn này được tận dụng để chưng cất lại thu cồn cao độ. Sau khi tủa cồn xong thì tiến hành cho kết tủa thu được vào hút chân không bằng máy hút chân không. Hút chân không loại nước và cồn tới khi fucoidan khô. Tuy nhiên khi hút chân không xong thì fucoidan vẫn còn rất ẩm, bị dính tay khi rờ. Vì vậy cần tiến hành cho fucoidan vào sấy đến khối lượng không đổi ở 500C trong 18 giờ. Lúc này fucoidan đã khô nên quá trình sấy kết thúc.
Do tiến hành làm thí nghiệm trên quy mô nhỏ chỉ dùng 50g bột rong khô nên lượng fucoidan thu được ở đây không nhiều. Vì vậy trong công đoạn sấy khô cần tiến hành thật cẩn thận sao cho thu được lượng fucoidan triệt để nhất.
Cuối cùng, cân lượng fucoidan thu được bằng cân phân tích, ghi lại lượng fucoidan để so sánh với các phương pháp tách chiết khác.
Phương pháp chiết tách fucoidan của bản quyền EP0645143A1:
Hình 2.3. Sơ đồ chiết fucoidan theo bản quyền EP0645143A1
(a) Phương pháp chiết fucoidan trong môi trường nước (b) Phương pháp chiết fucoidan trong môi trường acid pH=2 Huyền phù nước:rong = 3 Đun nóng ở 1000C từ 10 đến 60 phút Ly tâm loại bỏ bã rong + CaCl2 đạt 0.5 đến 1g/l. Ly tâm loại bỏ acid aginic.
Chạy qua siêu lọc 3 lần, mỗi lần với 10 lần thể tích nước cất.
Đông khô hoặc tạo kết tủa với 2 lần thể
tích EtOH
Sấy chân không
Fucoidan Huyền phù dd HCl:rong = 3 PH = 2 Đun nóng 25-1000C 10 đến 60 phút. Ly tâm loại bỏ bã rong + CaCl2 đạt 0.5 đến 1g/l. Ly tâm loại bỏ acid aginic
Chạy qua siêu lọc 3 lần, mỗi lần với 10 lần thể tích nước cất.
Đông khô hoặc tạo kết tủa với 2 lần thể tích EtOH
Sấy chân không
Fucoidan
Do thiết bị siêu lọc rây phân tử không có để thực hiện thí nghiệm nên trong thí nghiệm này tôi không sử dụng thiết bị này mà thay và đó là thiết bị lọc cát và than hoạt tính và thiết bị lọc trao đổi ion để làm thí nghiệm. Dựa theo bản quyền EP0645143A1 tiến hành bố trí thí nghiệm tách chiết fucoidan như sau:
Phương pháp chiết fucoidan trong môi trường nước:
Cân 50g rong khô đã xay thành bột hòa trộn với 1154 ml nước máy rồi cho vào bình thủy tinh chịu nhiệt. Tiến hành đun nóng mẫu trong bình thủy tinh bằng bếp điện ở 1000C trong vòng 45 phút. Khi khối rong đạt được nhiệt độ là 1000C trong thời gian 45 phút thì ngưng lại không đun nữa, sau đó để nguội và loại bã rong, thu dịch. Dịch rong thu được sau đó sẽ loại bỏ alginate bằng cách cho CaCl2
vào dịch. Kết tủa thu được là alginate-canxium sẽ được tách ra khỏi dịch rong bằng cách lọc vải. Lúc này dịch rong vẫn còn chứa các tạp chất rắn lơ lửng mà lọc vải chưa loại bỏ hết được nên tiếp tục cho dịch rong chạy qua cột cát và than hoạt tính. Tương tự như thí nghiệm trên cũng tiến hành cho dịch rong chạy qua cột nhựa trao đổi ion để loại bỏ các ion dương trong dịch rong.
Khi dịch rong đã trong không còn gợn tạp nữa thì tiến hành kết tủa dịch rong bằng cồn 900 theo tỉ lệ cồn: dịch rong là 2:1. Để 1 thời gian cho kết tủa lắng xuống dưới đáy, sau đó sẽ gạn hết cồn lớp trên và cho đi chưng cất lại thu cồn cao độ để sau này dùng để kết tủa tiếp. Kết tủa fucoidan thu được dưới đáy thùng sẽ được đem đi hút chân không và sấy cho tới khô. Tiến hành hút chân không và sấy tương tự thí nghiệm trên. Cân và ghi lại lượng fucoidan thu được để tiến hành so sánh với những mẫu còn lại.
Phương pháp tách chiết fucoidan trong môi trường acid pH=2:
Lấy 50g bột rong khô cho vào bình tam giác. Chuẩn bị dung dịch HCl có pH=2 với thể tích cần cho thí nghiệm này là 1154 ml. Sau đó hòa trộn, khuấy đều dung dịch HCl này với 50g rong đã chuẩn bị sẵn.
Tiến hành nâng nhiệt cho mẫu thí nghiệm từ 25 – 1000C trong vòng 45 phút, sau đó loại bỏ bã rong. Dịch thu được cũng được kết tủa loại alginate bằng cách cho CaCl2 vào dịch với khối lượng CaCl2 là 5g. Tiếp theo tiến hành lọc vải để loại bỏ
alginate. Tiến hành lọc dịch thu được qua cột cát và than hoạt tính nhằm loại bỏ hết các tạp chất có khối lượng phân tử lớn còn lơ lửng trong dịch rong.
Khi dịch rong đã được lọc qua cột cát và than hoạt tính thì dịch đã trong không còn gợn tạp nữa thì tiến hành lọc qua cột nhựa trao đổi và kết tủa fucoidan bằng cồn 900 với thể tích gấp 2 lần so với dịch rong. Để lắng kết tủa và gạn lấy kết tủa đem đi hút chân không và sấy tương tự các thí nghiệm trên. Cân và ghi lại khối lượng fucoidan thu được.
Phương pháp chiết tách fucoidan dự kiến:
Nước
CaCl2
Bã rong EtOH
Hình 2.4. Sơ đồ tách chiết fucoidan dự kiến. Rong Nâu Phân loại Rửa 1 Rửa 2 Nghiền bột Tủa Alginate Lọc vải thô
Lọc cát và than hoạt tính Lọc qua cột nhựa Nấu Tách kết tủa Hút chân không Sấy kết tủa Fucoidan Ngâm Kết tủa Phơi khô
Thuyết minh quy trình:
- Nguyên liệu: rong nâu là loại rong tươi, lấy ở biển Hòn Chồng – Nha Trang, là hỗn hợp nhiều loại rong Nâu. Rong đạt tiêu chuẩn về độ trưởng thành, về kích thước, màu sắc, độ to của phao.
- Phân loại: nhằm loại bỏ phần rong bị dập, mềm, biến đen, độ nhớt tăng. Đảm bảo chất lượng rong đồng đều, cần loại bỏ rong tạp và tạp chất. Phân loại và chọn ra loài rong nâu Sargassum polycystum để tiến hành thí nghiệm.
- Rửa 1: Rửa bằng nước biển, thường khi lấy rong lên thì ta tiến hành rửa tại chỗ, nơi nước sạch và trong. Rửa phải đều tay, vuốt sạch rong, tránh dồn cục khi rửa để đảm bảo sạch rong. Loại bỏ đất cát, san hô và các tạp chất ngay ở công đoạn này. Sau khi rửa xong, rong được cho vào bao sạch và đưa lên bờ, chú ý giảm tiếp xúc với cát, tránh dính bám cát vào rong. Thời gian rửa nhanh, cần chuyển lên bờ để làm các công đoạn sau.
- Rửa 2: Công đoạn này rửa bằng nước ngọt, dùng vòi nước cho chảy nhẹ và ngập rong, tiến hành rửa sạch, vuốt theo chiều cây rong, rửa qua 3 đến 4 lần nước ngọt để loại một phần muối dính bám vào rong và vi sinh vật trên cây rong. Trong công đoạn này nếu còn sót san hô hoặc các tạp chất thì cần loại bỏ ngay.
- Ngâm: Sau khi rửa thì ngâm nước ngọt trong vòng 24 giờ, mục đích là để loại bỏ bớt các chất màu, các muối và các hợp chất có trọng lượng phân tử thấp tan được vào trong nước có trong rong.
- Phơi khô: rong sau khi rửa sạch và ngâm đủ 24 giờ thì tiến hành vớt rong ra và phơi rong. Rong được rải đều trên các dàn phơi. Cách 2 giờ thì trở mặt rong 1 lần nhằm tăng diện tích tiếp xúc với ánh nắng và lưu thông không khí tốt. Nếu trời nắng to thì chỉ cần phơi trong vòng 2 ngày. Vì khi đã tiếp xúc với nước ngọt thì rong rất nhanh bị nhão ra nên cần phơi rong vào những ngày nắng to để rong nhanh chóng khô tránh hư hỏng rong. Sau khi phơi khô thì rong Nâu chuyển sang màu nâu đen, giòn, cứng. Sau đó thì cho vào bao, để ở nơi khô ráo thoáng mát và ở nhiệt độ thường để cân bằng độ ẩm. Sau khoảng 2 giờ thấy cọng rong dai và chắc thì tiến hành công đoạn tiếp theo.
- Nghiền bột: cho vào máy nghiền rong khô thành bột. Sau đó tiến hành bảo quản rong trong bao kín, đảm bảo chống mốc, chống hút ẩm để sử dụng được lâu và đảm bảo chất lượng rong.
- Nấu: cân 50g bột rong khô cho vào bình tam giác chịu nhiệt, cho 1500ml nước vào khuấy trộn với bột rong, tiến hành nấu huyền phù này với dung dịch 2.5 ml KOH có mặt Hydropeoxit (H2O2) với thể tích là 1.25ml ở nhiệt độ 600C trong thời gian 50 phút. Khi nấu nên tiến hành khuấy đảo để tăng quá trình trao đổi nhiệt đồng thời giảm lượng bột trào lên.
- Tủa Alginate: Cho 5g CaCl2 vào hỗn hợp rong ở trên để kết tủa alginate. Có một tính chất quan trọng của alginate có trong rong là có khả năng tạo kết tủa với Ca2+ trong môi trường trung tính nên việc cho CaCl2 vào sẽ có tác dụng tủa Alginate sau đó được loại ra khỏi dịch rong. Alginate-canxi kết tủa đồng thời kéo theo bã rong và các hạt rắn tách hẳn khỏi nước, dịch chiết còn lại sẽ rất trong, polysaccharide chỉ còn fucoidan và laminaran. Nếu kết tủa alginate bằng calcium, kết tủa AlgCa (alginate calcium) sẽ kết chặt với bã rong thành khối bền vững, đồng thời các kết tủa sẽ hấp thụ mạnh anion và cation kim loại nặng có chứa trong dịch chiết do đặc tính của AlgCa.
- Lọc qua vải: Loại bỏ bã rong cùng với kết tủa alginate bằng cách lọc hỗn hợp rong qua vải.
- Lọc qua cát và than hoạt tính: Dịch rong thu được cho chạy qua cột cát và than hoạt tính để loại bỏ hết các hợp chất rắn lơ lửng nằm trong dịch chiết mà lọc vải chưa loại bỏ hết. Cát và than hoạt tính sẽ giữ lại trên bề mặt của chúng các hợp chất này và loại chúng ra khỏi dịch rong.
- Lọc qua hạt nhựa trao đổi ion: Cho dịch rong thu được chạy qua cột nhựa trao đổi ion để loại bỏ ion dươngcó trong dịch rong.
- Kết tủa: Hai lần thể tích cồn 900 được thêm vào dịch chiết, fucoidan được tách ra dưới dạng kết tủa, một số các hợp chất hữu cơ khác (nếu còn) sẽ ở lại trong dung dịch cồn, ví dụ như: steroid, ankaloid, acetogenin, terpenoid… Cần nói thêm, sau khi kết tủa cồn xong thì dịch chiết lúc này có nồng độ cồn là 65%, ở nồng độ này
Fucoidan sẽ kết tủa. Còn hợp chất Laminaran trong rong chỉ kết tủa khi nồng độ cồn lớn hơn 85%. Vì vậy kết tủa thu được đảm bảo chỉ có Fucoidan mà hoàn toàn không chứa Laminaran. Sau đó quấy mạnh tay để quá trình kết tủa xảy ra nhanh hơn.
- Tách kết tủa: Sau khi kết tủa xong thì để một thời gian cho kết tủa lắng xuống hết dưới đáy để thuận lợi cho quá trình tách kết tủa. Sau đó gạn lớp cồn phía trên đi (có thể tận dụng để chưng cất lại), chỉ còn lại lớp kết tủa phía dưới đáy.
- Hút chân không: Dùng máy hút chân không để hút cồn và nước còn sót lại trong kết tủa. Lúc này kết tủa sẽ khô hơn tuy nhiên vẫn còn rất ẩm. Công đoạn hút chân không này nhằm tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình sấy kết tủa sau.
- Sấy kết tủa: Tiến hành sấy kết tủa trong tủ, sấy đến khi đạt độ khô giòn thì kết thúc. Thường khi khô thì cứng, không ẩm khi đặt tay vào. Quá trình sấy kết thúc, thu được sản phẩm fucoidan.