STT Thành phần V(µl)/1 phản ứng Nồng độ cuối cùng 1 H2O 1.5 - 2 Quantifast 2X mastermix 7.5 1X 3 Cặp primer HPV16 0.6 400nM 4 Cặp primer HPV18 0.6 400nM 5 Cặp primer HPV33/52 0.6 400nM 6 Cặp primer HPV IC 0.6 400nM 7 Probe HPV16 0.15 100nM 8 Probe HPV18 0.15 100nM 9 Probe HPV33/52 0.15 100nM 10 Probe IC 0.15 100nM 11 ADN HPV 3 Tổng 15 -
2.2.2 Tạo chứng dƣơng và xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
Chứng dương của kỹ thuật realtime PCR là hỗn hợp của 3 plasmid mang các đoạn chèn của trình tự đích do đó ln được nhận biết khi có mặt trong phản ứng realtime PCR. Sản xuất chứng dương bằng cách tạo ra các plasmid mang đoạn chèn là trình tự đích. Giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 được xác định bằng số bản copi tối thiểucủa chứng dươngtrong một phản ứng mà kỹ thuật realtime PCR vẫn phát hiện được.
2.2.2.1 Khuếch đại trình tự gen đích của phản ứngRealtimePCR
Trình tự gen đích gồm HPV16E6-E7, HPV18 L1 và HPV52 L1. Do cặp primervà probe phát hiện HPV33/52 phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu giống nhau trên cả 2 chủng HPV33 và 52 nên sử dụng trình tự HPV52L1 để tạo chứng dương cho tác nhân HPV33/52.
Thiết kế primer khuếch đại các trình tự đích
Trình tự primer dùng để khuếch đại gen E6-E7 của chủng HPV 16 được tham khảo từbài báo[24] trên cơ sở dữ liệu Pubmed (NCBI). Trình tự gen L1 của các chủng HPV18, HPV52 ngoài việc sử dụng cho nghiên cứu chính này cịn được sử dụng cho những nghiên cứu chuyên sâu hơn, nên nhóm nghiên cứu tham khảo các trình tự gen L1 của các chủng HPV18, 52 trên cơ sở dữ liệu Nucleotide (NCBI) và tự thiết kế cặp primer khuếch đại gen L1 của các chủng HPV18 và HPV52. Sử dụng các phần mềm tin sinh Mega5, Primer5 đánh giá lại cặp primer được lựa chọn. Thiết kế được 3 cặp primer để khuếch đại trình tự đích của phản ứng Realtime PCR HPV16 E6-E7, HPV18 L1 và HPV52 L1cho các đoạn sản phẩm có kích thước tương ứnglà 876bp, 1720bp và 1606bp.
Phản ứng PCR khuếch đại các trình tự đích
Phản ứng PCR được sử dụng để khuếch đại các trình tự gen E6-E7 của HPV16 và L1của HPV18, 52. Tiến hành tối ưu hóa các điều kiện phản ứng cho từng cặp primer: nồng độ primer, dNTP, MgCl2, nồng độ và loại enzyme (Dream Taq, green 2X Master mix, Fedili Taq), nhiệt độ gắn primer. Các thành phần, nồng độ tương ứng và chu kì nhiệt của phản ứng PCR đươ ̣c trình bày ở Bảng 2.3 và Bảng 2.4.Sản phẩm PCR được điện di kiểm tra trên gel agarose 1.5%.