STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 IC 1 A410 HPV16 Dương tính
/27,2 Âm tính Âm tính Dương tính /26,9 2 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính /36,4 Dương tính /23,4 Dương tính /24,5 3 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Bảng 3.10B. Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập thực hiện bởi kỹ thuật viên 2
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 IC 1 A410 HPV16 Dương tính
/29,9 Âm tính Âm tính Dương tính /28,1 2 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính /34,0 Dương tính /23,9 Dương tính /25,8 3 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Bảng 3.10C.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập thực hiện bởi kỹ thuật viên 3
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 IC 1 A410 HPV16 Dương tính
/29.7 Âm tính Âm tính Dương tính /28.4 2 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính /34.0 Dương tính /24.0 Dương tính /25.7 3 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Hình 3.18A. HEX Hình 3.18B. Cy5
Hình 3.18C. FAM Hình 3.18D.Cy5.5 A410 (HPV16); B252 (HPV18, 52)
Hình 3.18.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật
viên 1(Hình 3.18A, B, C, D tương ứng vớikênh HEX, Cy5, FAMvà Crimson)
Hình 3.19A.HEX Hình 3.19B.Cy5
Hình 3.19C.FAM Hình 3.19D.Cy5.5
A410 (HPV16); B252 (HPV18, 52)
Hình 3.19.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật
viên 2 (Hình 3.19A, B, C, D tương ứng với kênh HEX, Cy5, FAM vàCy5.5)
Hình 3.20A.HEX Hình 3.20B.Cy5
Hình 3.20C.FAM Hình 3.20D.Cy5.5
A410 (HPV16); B252(HPV18, 52)
Hình 3.20.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật
Bảng 3.11. Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập
Tên mẫu/ kênh đọc Mean 1SD 2SD
A410(HPV16)/HEX 28,9 1,5 3
B252(HPV18)/Cy5 34,8 1,4 2,8 B252(HPV52)/FAM 23,8 0,3 0,6
Mean - Giá trị trung bình; SD – Độ lệch chuẩn
Hình 3.21A
Hình 3.21B
Hình 3.21C
Hình 3.21 Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập
(Hình 3.21 A, B, C tương ứng vớikênh HEX, Cy5 vàFAM)
Từ kết quả trên chúng tôi đưa ra kết luận: kỹ thuậtRealtime PCR xác định các chủng HPV16, 18 và 33/52 cho kết quả thống nhất giữa các lần thí nghiệm khác nhau do cùng 1 kỹ thuật viên thực hiện và do 3 kỹ thuật viên khác nhau .
3.3.3 Xác định độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
Tiến hành kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe với 20 mẫu âm tính với chủng HPV16, 18, 33 và 52 của bộ mẫu chuẩn trong đó gồm 8 mẫu âm tính với HPV và 12 mẫu âm tính với 4 chủng HPV16, 18, 33 và 52 nhưng dương tính với các chủng HPV khác. Kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.12 và Hình 3.22.
Bảng 3.12.Kết quả thí nghiệm xác định độ đặc hiệu của phương pháp
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả (dương tính/âm tính /Ct) HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 1 B455 HPV45 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 23,9
2 A556 HPV35,68 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,2
3 A531 HPV56 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 24,0
4 A352 HPV31 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,3
5 A218 HPV39 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 31,0
6 B511 HPV68 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,4
7 A259 HPV56,62 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,9
8 A448 HPV62 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 23,5
9 A243 HPV66 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 24,4
10 B473 HPV66,81 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 24,7
11 A319 HPV68 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 24,8
12 A514 HPV11 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,1
13 A1 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,0
14 A2 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,7
15 A3 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,1
16 A4 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 23,8
17 A5 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 23,5
18 A6 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 24,8
19 A7 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 26,8
20 A8 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,9
21 Chứng dương HPV16, 18, 33/52 Dương tính /23,5 Dương tính /27,5 Dương tính /19,9 Âm tính 22 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
(*)
Mẫu âm tính với các chủng HPV
Hình 3.22A. HEX Hình 3.22B.Cy5
Hình 3.22C.FAM Hình 3.22D.Cy5.5
B455; A556; A531; A352; A218; B511; A259; A448 A243; B473; A319; A514; A1; A2; A3; A4; A5; A6 A7; chứng dương
Hình 3.22.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu
(Hình 3.22A, B, C, D tương ứng với kênh HEX, Cy5, FAM và Cy5.5)
Chú thích: màu nâu tương ứng với chứng dương, các màu còn lại tương ứng với các mẫu âm tính với một trong bốn chủng hoặc cả 4 chủng HPV16, 18, 33 và 52
Phân tích kết quả trên cả 4 kênh đọc cho thấy cả 20 mẫu âm tính của bộ mẫu chuẩn đều cho kết quả âm tính trên các kênh HEX, Cy5và FAM (Bảng 3.12). Chứng tỏ cả 20 mẫu này đều âm tính với các chủng HPV16, 18, 33, 52 khi xác định bằng phương pháp mới, tỷ lệ các mẫu âm tính xác định bằng phương pháp mới xây dựng trên 20 mẫu âm tính của bộ mẫu chuẩn là 100%. Chứng dương, chứng âmvà cặp primer, probe IC (cho tín hiệu ở kênh Cy5.5) được sử dụng để kiểm soát chất lượng của kỹ thuật realtime PCR. Ở các kênh HEX (Hình 3.22A), Cy5 (Hình 3.22B) và FAM (Hình 3.22C) chỉ xuất hiện 1 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang điển hình của chứng dương, tương ứng với kết quả dương tính của chứng dương trên cả 3 kênh đọc đó, điều này chứng tỏ quá trình thực hiện phản ứng Realtime PCR đã bổ sung đầy đủ các thành phần cần thiết cho phản ứng. Cặp primer, probe IC nhận biết 1 đoạn trình tự trên gen HMBS (ln có mặt trong mẫu) nên ln cho kết quả dương tính trên kênh Cy5.5 khi phản ứng có mặt của mẫu, do đó khi phân
quang điển hình tương ứng với tất cả các mẫu thí nghiệm. Kết quả này chứng tỏ q trình thao tác thí nghiệm người thực hiện đã bổ sung đầy đủ mẫu vào tất cả các phản ứng. Chứng âm cho kết quả âm tính trên cả 4 kênh đọc chứng tỏ khơng có sự nhiễm chéo trong thao tác thí nghiệm.Từ đó, chúng tơi rút ra kết luận tỷ lệ kết quả âm tính xác định bằng kỹ thuật realtime PCR so với kết quả âm tính của mẫu chuẩn là 100%.
3.3.4 Xác định độ nhạycủa kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 18 và 33/52
Tiến hành kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe với 20 mẫu dương tính với ít nhất một trong các chủng cần phát hiện và mẫu này là mẫu thuộc bộ mẫu chuẩn của nghiên cứu. Gồm 8 mẫu dương tính với HPV16, 7 mẫu dương tính với HPV18 và 6 mẫu dương tính với HPV52 và 2 mẫu dương tính với HPV33. Kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.13 và Hình 3.23.
Quan sát Hình 3.23A, B, C đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kì của các mẫu dương tính là điển hình, kết quả được tổng kết lại ở Bảng 3.11 như sau: trong 20 mẫu dương tính của bộ mẫu chuẩn có 8 mẫu HPV16 cho kết quả dương tính ở kênh HEX, 7 mẫu HPV18 cho kết quả dương tính ở kênh Cy5 và 7 mẫu HPV33/52 cho kết quả dương tính ở kênh FAM. Tỷ lệ các mẫu dương tính xác định bằng phản ứng Realtime PCR trên 20 mẫu dương tính với 1 trong các chủng HPV16, 18, 33/52 của bộ mẫu chuẩn là 100%. Tỷ lệ mẫu dương tính với từng chủng HPV16, 18, 33/52 khi xác định bằng kỹ thuật realtime PCR trên các mẫu dương tính tương ứng đều là 100% (8/8 mẫu HPV16, 7/7 mẫu HPV18, 7/7 mẫu HPV33/52).Kênh Cy5.5 cho giá trị Ct tương đương giữa các mẫu, chứng tỏ thao tác thí nghiệm tra mẫu đã được thực hiện đầy đủ ở tất cả các phản ứng và không xuất hiện yếu tố ức chế đối với phản ứng PCR.Chứng âm cho kết quả âm tính ở cả 4 kênh đọc chứng tỏ khơng có sự nhiễm chéo trong q trình thao tác thí nghiệm.
Kết luận: tỷ lệ kết quả dương tính xác định bằng kỹ thuật Realtime PCR trong tổng số kết quả dương tính của bộ mẫu chuẩn là 100%.
Bảng 3.13.Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy của phương pháp
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 IC 1 A305 HPV16 Dương tính
/24,9 Âm tính Âm tính Dương tính /26,8 2 A435 HPV16 Dương tính
/23,1 Âm tính Âm tính Dương tính /25,2 3 A410 HPV16 Dương tính
/27,2 Âm tính Âm tính Dương tính /26,9 4 A445 HPV16 Dương tính
/27,9 Âm tính Âm tính Dương tính /23,9 5 B344 HPV16 Dương tính
/25,0 Âm tính Âm tính Dương tính /25,7 6 TEB064 HPV16 Dương tính
/26,3 Âm tính Âm tính Dương tính /26,4 7 TEB101 HPV16 Dương tính
/20,2 Âm tính Âm tính Dương tính /20,9 8 TEB094 HPV16, 18 Dương tính /34,1 Dương tính /25,5 Âm tính Dương tính /23,2 9 A147 HPV18 Âm tính Dương tính
/32,0 Âm tính Dương tính /23,1 10 A268 HPV18 Âm tính Dương tính
/29,1 Âm tính Dương tính /23,5 11 A264 HPV18 Âm tính Dương tính
/28,06 Âm tính Dương tính /24,27 12 B542 HPV18 Âm tính Dương tính
/28,41 Âm tính Dương tính /24,45 13 TEB068 HPV18 Âm tính Dương tính
/33,08 Âm tính Dương tính /24,09 14 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính /36,40 Dương tính /23,38 Dương tính /24,51 15 B557 HPV52 Âm tính Âm tính Dương tính
/23,46
Dương tính /23,37 16 A103 HPV52 Âm tính Âm tính Dương tính
/22,30
Dương tính /23,49 17 A424 HPV33, 52 Âm tính Âm tính Dương tính
/18,74
Dương tính /24,36 18 A458 HPV52 Âm tính Âm tính Dương tính
/21,34
Dương tính /23,77 19 B578 HPV52 Âm tính Âm tính Dương tính
/24,10
Dương tính /23,47 20 B206 HPV33 Âm tính Âm tính Dương tính
/21,75
Dương tính /25,92 21 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Hình 3.23A HEX Hình 3.23B Cy5 Hình 3.23C FAM Hình 3.23D Cy5.5
A305; A435; A410; A445; B344; TEB064; TEB101 A147; A268; A264; B542; TEB068; TEB094; B252 B557; A103; A424; A458; B578; B206
Hình 3.23.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ nhạy
(Hình 3.23A, B, C, D tương ứng vớikênh HEX, Cy5, FAM vàCy5.5) Chú thích:
Màu tương ứng với các mẫu A305, A435, A410, A445, B344, TEB064, TEB101, TEB094 thuộc genotype HPV16
Màu tương ứng với các mẫu A147, A268, A264, B542, TEB068, TEB094, B252 thuộc genotype HPV18
Trong rất nhiều yếu tố nguy cơ của ung thư cổ tử cung thì HPV được coi là tác nhân liên quan mật thiết nhất. Do sự biến động di truyền của HPV giữa các khu vực khác nhau nên có rất nhiều nghiên cứu phát hiện HPV nói chung và phát hiện HPV bằng kỹ thuật multiplex Realtime PCR nói riêng[34][28][25][39];v.v… Tuy nhiên các nghiên cứu nói trên đã xây dựng phương pháp phát hiện được sự có mặt của các chủng HPV và đưa ra tỷ lệ nhiễm HPV ở từng khu vực.Trong một số nghiên cứu phát hiện HPV bằng kỹ thuật multiplex Realtime PCR khác có đưa ra đánh giá về giới hạn phát hiện của phương pháp thơng qua việc tính số bản copy thấp nhất mà kỹ thuật realtime PCR phát hiện đượcnhư nghiên cứu Daojun Yu (2012) [17] và William T Seaman (2010)[38] có đưa ra phương pháp phát hiện sự có mặt của các chủng HPV 6, 11, 16, 18 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Realtime PCR với độ nhạy tương ứng là 101 – 102 copy/ phản ứng và 2x101 – 2x106 copy/ phản ứng. Từ đó có thể thấy so với các phương pháp phát hiện HPV cùng dựa trên kỹ thuật Realtime PCR thì phương pháp chúng tơi xây dựng được có độ nhạy cao hơn là 3 – 30 copy/phản ứng. Phương pháp của chúng tơi có độ nhạy cao hơn do các nguyên nhân sau: primer và probe thiết kế là hoàn toàn đặc hiệu, nhận biết trình tự có tính phân biệt cao giữa các chủng HPV và ko có cấu trúc hairpin; Thành phần của kỹ thuật realtime PCR là hợp lý.
Kit Cobas 4800HPV, Roche (FDA) – kit xét nghiệm HPV nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung dựa trên kỹ thuật realtime PCR cũng đưa ra đánh giá về giới hạn phát hiện của kit đối với các chủng HPV16, 18, 33/52 tương ứng là 300, 300, 2400 copy/ml trong mẫu dịch quét cổ tử cung.Trong nghiên cứu này, cứ 200ul dịch quét cổ tử cung tách chiết bằng kit tách chiết ADN của Roche thu được 50ul ADN, tương ứng với nồng độ 1 copy/ul trong ADN là 250 copy/mldịch tách chiết, giới hạn phát hiện của HPV16, 18, 33/52 là 1, 1, 10/10 copy/ul dịch tách chiết thì có 250, 250, 2500/2500 copy/ml dịch tách chiết, kết quả thu được cũng tương tự với kết quả của kit.
Phương pháp phát hiện HPV đang xây dựng ngồi việc có độ nhạy cao hơn các nghiên cứu phát hiện HPV với cùng kỹ thuật realtime PCR và độ nhạy tương đương với kit thương mại Roche cịn có ưu điểm:
+ Phương pháp phát hiện HPV 16, 18, 33/52 có sử dụng cặp mồi chứng nội kiểm (IC) và chứng dương kiểm soát chất lượng của xét nghiệm: sử dụng cặp
ức chế trong kỹ thuật realtime PCR; đồng thời sử dụng chứng dương để kiểm soát các thao tác thí nghiệm ở bước thực hiện kỹ thuật realtimePCR.
+Tiếp tục phát triển phương pháp cho các mục đích nghiên cứu khác: khác với các kít thương mại phát hiện HPV bằng kỹ thuật realtime PCR thường phụ thuộc vào thiết bị, thành phần sinh phẩm như kit cobas 4800 Roche chỉ sử dụng trên hệ thiết bị kín và sinh phẩm của hãng, phương pháp này là một hệ mở có thể bổ sung thêm các cặp mồi và probe phát hiện các chủng Lr-HPV và Hr-HPV khác vào trong cùng phản ứng realtime PCR hoặc trong một phản ứng realtime PCR riêng biệt khác với thành phần tương tự như trong kỹ thuật realtime PCR phát hiện HPV16, 18, 33/52. Do đó có thể tiếp tục phát triển phương pháp này để phát hiện các chủng HPV tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu, xét nghiệm thực tiễn, ví dụ như phát hiện các chủng nguy cơ cao có trong thành phần của vắc xin 9 giá, phát hiện các chủng HPV nguy cơ thấp, gây mụn cóc sinh dục như HPV6, 11, v.v…Phương pháp này không chỉ được sử dụng để xác định nguy cơ ung thư cổ cung cho phụ nữ mà còn có thể tiếp tục phát triển để xác định nguy cơ một số bệnh khác cũng do HPV gây ra như: mụn cóc sinh dục, sùi mào gà, ung thư dương vật.
+ Ngoài ra, phương pháp này có những ưu điểm của kỹ thuật multiplex realtime PCR nói chung là nhanh, độ chính xác cao, phát hiện một lúc được nhiều tác nhân, giá thành rẻ hơn các Kít thương mại đang sử dụng để sàng lọc HPV trên thị trường, chi phí cho 1 xét nghiệm sàng lọc các chủng HPV16, 18, 33/52 theo phương pháp chúng tôi xây dựng là 160.000 VND tiết kiệm hơn rất nhiều so với chi phí cho 1 xét nghiệm sàng lọc HPV với Kit Cobas 4800 HPV, Roche (FDA) hiện là 750.000 VND.
KẾT LUẬN
Thiết kế thành công phương pháp phát hiện các chủngHPV16, 18 và 33/52 bằng kỹ thuật Realtime PCR có sử dụngchứng nội kiểm (IC)và chứng dương với giới hạn phát hiện các tác nhân tương ứng là 3, 3 và 30/30 copy/phản ứng.
Xác định các chỉ tiêu thẩm định kỹ thuật Realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52:
Độ chính xác: phản ứng multiplexRealtime PCR nhóm thiết kế cho kết quả thống nhất với kết quả của bộ mẫu chuẩn được xác định trước đó.
Độ chụm: phản ứng multiplex Realtime PCR cho kết quả thống nhất giữa các xét nghiệm riêng lẻ cũng như giữa các kỹ thuật viên khác nhau.
Độ đặc hiệu của phản ứng multiplex Realtime PCR là 100%. Độ nhạycủa phản ứng multiplex Realtime PCR là 100%.
KIẾN NGHỊ
Từ thực tế quá trình nghiên cứu chúng tơi đưa ra một số kiến nghị sau:
1. Tiếp tục phát triển phương pháp để có thể phát hiện được các chủng HPV nguy cơ cao khác và cả các chủng HPV nguy cơ thấp.
2. Đánh giá phương pháp với các tác nhân khác HPV cũng có mặttrên đường sinh dục: lậu, giang mai, v.v và tác nhân HPV thu được ở khu vực khác trên