Phương pháp lai Southern-blot
Nguyên tắc lai Southern-blot dựa trên khả năng tiếp nhận ADN của màng lai nitrocellulose. Sự ra đời của phương pháp điện di trên gel đã cho phép phân tách các đoạn ADN được cắt bởi enzym cắt giới hạn dựa trên kích thước của chúng và phương pháp chuyển ADN từ gel sang màng lai nitrocellulose là cơ sở cho sự ra đời của phương pháp lai do E.M Southern mô tả năm 1975.
Lai Southern-blot là phương pháp được ứng dụng sớm nhất trong phát hiện HPV. Đây là phương pháp có độ nhạy rất cao, cho phép phát hiện đoạn ADN đích sử dụng các mẫu dò được đánh dấu bằng phóng xạ (hệ thống phát hiện bằng enzym). Các điều kiện cho q trình lai có thể được kiểm soát tại các thời điểm khác nhau trong hoặc sau quá trình lai bằng cách thay đổi nhiệt độ và nồng độ muối. Có nhiều phương pháp đánh dấu mẫu dị oligonucleotid khác nhau được sử dụng nhưng đa số mẫu dò thường đánh dấu ở đầu 5’ bằng 32P hoặc bằng các chất khơng phải là phóng xạ như chất nhuộm huỳnh quang đã được gắn với horseradish peroxydase, với alkaline phosphatase, với digoxygenin. Sau đó, phức hợp mẫu dò đã đánh dấu sẽ được phát hiện bởi các kháng thể đặc hiệu[5].
Lai Southern-blot có thể sử dụng ADN tách từ bệnh phẩm đã bảo quản hoặc bệnh phẩm tươi. Sự xuất hiện của sản phẩm lai được đánh giá như tiêu chuẩn chẩn đốn sự có mặt của HPV trong bệnh phẩm vì kích thước của kích thước của đoạn lai được đánh giá bằng nội kiểm dương đặc hiệu cho mỗi phản ứng. Tuy nhiên, độ đặc hiệu của phương pháp này không cao và cần thực hiện bắt buộc tại các phòng xét nghiệm chuyên sâu.
1.2.5.2.2 Khuếch đại mục tiêu
Phương pháp khuếch đại mục tiêu được sử dụng phổ biến nhất là PCR. Nhiều thí nghiệm PCR đặc hiệu chủng đã được phát triển để phát hiện sự có mặt của từng chủng HPV nhưng các nghiên cứu dịch tễ nói chung thường địi hỏi phải lý giải được sự có mặt của nhiều chủng HPVchủ chốttìm thấy trong đường sinh dục. Vấn đề này được giải quyết bằng cách khuếch đại một phần bộ gen HPVđươc bảo tồn bền vững như gen L1, xét nghiệm được gọi là PCR phát hiện HPV dựa trên đoạn gen L1. Xét nghiệm PCR phát hiện tất cả các chủng HPV được đưa ralần đầu tiên bởi Manos và cộng sự. Xét nghiệm này dùng cặp mồi MY09/11 khuếch đại đoạn sản phẩm dài 450 bp để phát hiện sự có mặt của HPVvà sau đó xác định chủng được thực hiển bằng các kỹ thuật khác như RFLP, giải trình tự ADNvà RBH với các đầu dị oligonucleotide đặc hiệu các chủng. Các cặp mồi bổ sung nhắm tới cùng một vùng mã hóa trong L1 được sử dụng khá rộng rãi, bao gồm GP5+/GP6+, SPF10khuếch đại đoạn sản phẩm tương ứng dài khoảng 160 bp, 65 bp. Do kích thước sản phẩm nhỏ nên các đoạn mồi GP5+/6+ vàSPF được sử dụng nhiều hơn với các mẫu bảo quản trong parafin để tăng độ nhạy của xét nghiệm với các acid nucleic đứt gãy. Do kích thước rất nhỏ sản phẩm khuếch đại mà phương pháp Elisa lai ADN trên đĩa được thực hiện nhiều cho mồi SPF. Việc phát hiện ra sản phẩm khuếch đại chứng tỏ sự hiện diện của HPV, với thể lai đặc hiệu có thể xác định được từng chủng HPV. Việc định typetừ các sản phẩm khuếch đại đểphát hiện tất cả các chủng HPV được thực hiện phổ biến nhất bằng RBH, trong đó sản phẩm khuếch đại lai với đầu dò đặc hiệu chủng gắn trên màng và sau đó phát hiện bằng phương pháp so màu hoặc quang hóa.Các phương phápkhuếch đại mục tiêu để phát hiện và định chủng HPV sử dụng được phát triển và sử dụng ngày càng nhiều và phong phú hơn. Các phịng thí nghiệm cần phải thẩm định lại độ nhạy và độ đặc hiệu của xét nghiệm mà họ sử dụng, cho dù đó là xét nghiệm tự xây dựng hay là xét nghiệm mua trên thị trường, nhằm đảm bảo rằng các xét nghiệm này sẽ nâng cao được khả năng chẩn đoán phát hiện HPV[43].
Bảng 1.3.Các cặp mồi dùng cho PCR phát hiện HPV[43]
Tên mồi Gen đích Chiều dài sản phẩm
MY09/MY11 L1 450 bp
GP5+/GP6+ L1 160 bp
Một số kit thương mại phát hiện HPV ADN dựa trên nguyên lý phản ứng PCR:
+ Kỹ thuật Reverse line blot (Roche Molecular systems - Alameda, CA) là kỹ thuật đầu tiên ứng dụng phương pháp PCR trong phát hiện HPV ADN và HPV genotype, dựa trên nguyên lý của PCR sử dụng primer PGMY09/11 khuếch đại vùng gen L1 HPV. Sản phẩm PCR được lai với các mẫu dò gồm các mẩu olionucleotid đặc hiệu đa type HPV gắn trên màng. Phức hợp gắn được phát hiện bằng mắt thường. Kỹ thuật này có thể phát hiện được 27 HPV genotype khác nhau trong đó có 11 type LR-HPV. Hiện nay, trên thương mại đã công bố Linear Array HPV Genotyping Test (Roche Diagnostics, Indianapolis, IN) có thể phát hiện 37 HPV genotype bao gồm 14 type LR-HPV. Đây là loại kit được sử dụng phổ biến nhất trong các phịng thí nghiệm ở Châu Âu, đã được FDA chấp thuận nhưngchưa được phê chuẩn. Ngoài ra, trên thương mại cịn có kit INNO-LiPA HPV Genotyping Extra (Innogenetics, Ghent, Begium) với nguyên lý lai Reverse line blot phát hiện 24 HPV genotype khác nhau, L1 ADN HPV được khuếch đại bằng primer SPF 10 và được lai với các probeđặc hiệu trên màng. Phương pháp này chỉ tập trung xác định sự có mặt của HPV qua gene L1, trong trường hợp virus đã xâm nhập vào trong tế bào và có sự cắt bỏ 1 số gen không cần thiết thì xác định bằng phương pháp này sẽ là khơng chính xác.
+ Amplicor HPV test (Roche Molecular Systems) là kỹ thuật có thể phát hiện 13 type HPV "nguy cơ cao". Nguyên lý kỹ thuật dựa trên phản ứngPCR khuếch đại sản phẩm lai sau khi ADN đích đã lai kháng thể đặc hiệu gắn huỳnh quang. Nhược điểm của kit là chỉ phát hiện được nhóm genotype HPV mà khơng phát hiện từng HPV genotype đặc hiệu. So sánh Amplicor với Hybrid Capture II Assay (cùng phát hiện được 13 type HPV "nguy cơ cao") cho thấy độ tương đồng là 83,3%[7].
+ Multiplex HPV Genotyping Kit (Multimetrix, Heidelberg, Gemany) là kỹ thuật gắn huỳnh quang sản phẩm PCR và mẫu dò đặc hiệu. Primer kit gồm 24 mẫu dò tương ứng 24 genotype HPV, 1 mẫu dò β-globin và 1 mẫu dò chứng. Sau khi sản phẩm PCR được lai với các mẫu dò sẽ được gắn R-phycoerythrin đã đánh dấu streptavidin và được đọc trên máy phân tích Luminex. Đây là Kit có độ nhạy cao và có thể ứng dụng cho các nghiên cứu dịch tễ học, tuy nhiên hiện nay Kit thường chỉ sử dụng cho mục đích nghiên cứu vì giá thành cao.
1.2.5.2.3 Phương pháp Realtime PCR
Các phương pháp PCR thơng thường chỉ đánh giá định tính mà khơng đánh giá định lượng vi rút. Real-time PCR là phương pháp khuếch đại đích có độ nhạy cao, thường được sử dụng trong định tính và định lượng ADN HPV.
Realtime PCR là kỹ thuật PCR mà kết quả khuếch đại ADN đích hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt của phản ứng, do đặc điểm này nên với realtime PCR người làm thí nghiệm khơng cần làm tiếp các thí nghiệm để xác định có sản phẩm khuếch đại đích hay khơng. Phản ứng realtime PCR cho phép phát hiện các bản sao được tạo ra trong từng chu kỳ nhiệt bằng cách sử dụng probe (đoạn dị)có khả năng phát huỳnh quang dưới tác động của nguồn sáng kích thích.Kết quả sản phẩm khuếch đại hiển thị ngay sau mỗi chu kỳ nhiệt dựa trên sự tỷ lệ thuận giữa tín hiệu huỳnh quang phát ra và số lượng bản sao ADN được tổng hợp.Do đó đây là phương pháp khuếch đại đồng thời cả mục tiêu và tín hiệu để phát hiện tác nhân đích.
Nguyên lý của kỹ thuật realtime PCR sử dụng Taqman probe: Trong phản ứng Realtime PCR ngoài các thành phần giống phản ứng PCR cơ bản cịn cần probe (probe) có thể phát huỳnh quang khi xuất hiện sản phẩm khuếch đại đặc hiệu. Probe là những đoạn oligonucleotide sợi đơn có trình tự bắt cặp bổ sung với một đoạn trình tự trên ADN đích, đầu 5’ có gắn huỳnh quang (reporter) cịn đầu 3’ gắn chất hấp phụ huỳnh qang tương ứng (quencher) để hấp phụ ánh sáng huỳnh quang phát ra từ reporter. Khi chưa có sự xuất hiện của sản phẩm khuếch đại, probe vẫn còn nguyên vẹn, huỳnh quang phát ra từ reporter ở đầu 5’ sẽ bị quencher ở đầu 3’ ở probe hấp phụ do vậy huỳnh quang sẽ không được phát ra dưới tác động của nguồn sáng kích thích. Khi bắt đầu xuất hiện sản phẩm khuếch đại, probe bắt cặp vào sợi khuôncủa sản phẩm sẽ cản trở hoạt động Enzyme Taq polymerase kéo dài primer tổng hợp mạch bổ sung, do đó probe sẽ bị enzyme này thủy phân bởi hoạt tính 5’-3’ exonuclease giải phóng ra đầu reporter của probe, reporter rời xa quencher sẽ phát được huỳnh quang khi nhận nguồn sáng kích thích. Sản phẩm khuếch đại càng nhiều thì số lượng reporter tự do càng lớn, dưới tác động của nguồn sáng kích thích mà cường độ huỳnh quang reporter đủ mạnh thì máy sẽ ghi nhận tín hiệu huỳnh quang phát ra từ ống phản ứng[4]. Multiplex realtime PCR nguyên lý cũng tương tự như kỹ thuật realtime PCR nhưng sử dụng nhiều probe trong cùng một phản ứng giúp tiết kiệm sinh phẩm, thời gian và phát hiện được nhiều tác nhân trong cùng một phản ứng.
Đường chuẩn của phản ứng được xây dựng dựa trên số lượng bản sao ADN đích trong một gam mẫu chuẩn và xác định giá trị chu kỳ ngưỡng cho từng mẫu tương ứng. Chu kỳ ngưỡng (Ct-threshold cycle) là chu kỳ nhiệt mà ở tại thời điểm đó sản phẩm PCR cho tín hiệu huỳnh quang tăng vọt vượt qua cường độ huỳnh quang nền. Nếu số lượng ADN đích càng lớn thì Ct càng nhỏ và nếu số lượng ADN đích ít thì cần nhiều chu kỳ nhiệt hơn. Phản ứng real-time PCR lý tưởng khi tín hiệu huỳnh quang tăng gấp đôi sau mỗi chu kỳ nhiệt.
Phương pháp real-time PCR có thể thực hiện nhanh, giá thành không đắt, định lượng được sản phẩm ADN và ARN. Phương pháp này có thể phát hiện được 10.000 chuỗi gen sao chép/phản ứng (khoảng 100 tế bào bị nhiễm)[4].
Trên thị trường có các loại Kit khác nhau dựa trên nguyên lý của realtime PCR như Roche LightCycler 2, GenoID realtime HPV Kit hoạt động trên hệ thống Applied Biosystems 7900 HT. Những kit này thường được sử dụng trong chẩn đoán
invitro tại Châu Âu, tuy nhiên vẫn chưa được FDA cơng nhận.
Cobas® kit 4800 Roche định tính HPV trong các mẫu bệnh phậm dựa trên nguyên lý là Realtime PCR, được FDA công nhận, đã được thương mại hóa, sử dụng rộng rãi để phát hiện các gennotype HR-HPV 16, 18, nhóm HPV31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68.
Từ những ưu điểm giá thành hợp lý, nhanh và chính xác nêu trên, chúng tôi quyết định chọn Realtime PCR là phương pháp dùng trong nghiên cứu.
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1 Vật liệu 2.1 Vật liệu
2.1.1 Đối tƣợng nghiên cứu
Mẫu nghiên cứu là mẫu ADN HPV từ dịch phết âm đạo của nữ giới ở độ tuổi 18 đến 45 ở Hà Nội và thành phố Hồ Chí Minh trong năm 2014. Các chủng HPV có nguy cơ cao (hrHPV) được phát hiện bởi bộ sinh phẩm Cobas 4800 (Roche, Đức). Đồng thời các mẫu kể trên được xác định chủng tại Viện Ung Thư- CHLB Đức và giải trình tự được một số gen E6, E7, L1. Bộ mẫu này được sử dụng như mẫu chuẩn của nghiên cứu.
Ở mục tiêu 1, chúng tôi sử dụng số lượng mẫu n <5 cho mỗi chủng HPV đang nghiên cứu để xây dựng phương pháp. Các trình tự genome HPV tìm thấy ở ngân hàng gen NCBI (từ khóa: human papillomavirus complete genome) được tải
về, tạo cơ sở cho việc thiết kế primer và probe.
Ở mục tiêu 2, chúng tôi sử dụng số lượng mẫu lớn hơn, đa dạng về genotype (n= 2-20) để đánh giá độ nhạy, độ đặc hiệu của phương pháp.
2.1.2 Sinh phẩm và vật tƣ tiêu hao
Sinh phẩm sử dụng trong nghiên cứu sử dụng trong nghiên cứu, bao gồm: - Sinh phẩm cho phản ứng Realtime PCR: các cặp primer và probe đặc hiệu với một số đoạn gen đặc trưng cho các chủng HPV nguy cơ cao(IDT, Mỹ); Quantifast Multiplex PCR Kit (QiaGen, CHLB Đức).
- Sinh phẩm cho tạo dòng và sản xuất chứng dương:
+ Sinh phẩm cho phản ứng PCR khuếch đại các gene 16E6-E7, 18L1, 52L1: các cặp primer tương ứng, H2O, DreamTaq buffer 10X, Enxyme DreamTaq, MgCl2, dNTPs và sinh phẩm cho điện di gồm agarose, Redsafe, TAE 1X.
+ Sinh phẩm cho nhân dòng: Kit tinh sạch ADN qua gel của Promega, môi trường nuôi cấy LB lỏng, môi trường nuôi cấy LB đặc, vector P-entry D.Topo, tế bào khả biến E. Coli TOP10, Kanamycine.
Các vật tư tiêu hao sử dụng trong nghiên cứu gồm: eppendoft 0.2ml, 0.5ml, 1.5ml (Bio Sorenson, Mỹ) , falcol, tip, đĩa ni cấy v.v...
2.1.3 Máy móc và thiết bị
Thiết bị của phịng thí nghiệm Miễn dịch Vắc Xin, Khoa Miễn Dịch và Sinh học phân tử, Viện Vệ sinh Dịch tễ Trung ương được sử dụng trong từng mục tiêu nghiên cứu như sau:
Mục tiêu 1
- Máy Realtime PCR Rotogen-Q (QiaGen, CHLB Đức) Mục tiêu 2
- Máy PCR Mastercycler epgradient S của Eppendoft (CHLB Đức), nguồn điện di (Biorad, Mỹ), bể điện di (Sigma, Mỹ), máy chụp ảnh gel (Biorad, Mỹ)
- Tủ ấm nuôi cấy vi khuẩn (NUAIRE, ), máy lắc, bể ổn nhiệt - Máy đo OD Nanodrop
Ngoài ra còn các thiết bị khác: tủ hood an toàn sinh học để trộn phản ứng PCR và tra mẫu, cân phân tích, máy vortex, máy minispin, máy li tâm, lị vi sóng, tủ lạnh -20ºC, tủ lạnh 4ºC v.v…
2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1Xây dựng kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV 16, 18,33/52
2.2.1.1 Thiết kế primer và probe cho phản ứng Realtime PCR
Trình tự primer được tham khảo từ các bài báo trên cơ sở dữ liệu Pubmed (NCBI). Các phần mềm tin sinh được sử dụng:
+ Primer 5: Kiểm tra các đặc điểm của primer và probe: chiều dài, %GC, cấu trúc hairpin, sự bắt cặp không đặc hiệu giữa hai primer hoặc giữa primer và trình tự đích; chiều dài sản phẩm, tính đặc hiệu của primer và probe với trình tự đích trên ADN HPV.
+ Mega 5: Kiểm tra tính đặc hiệu của primer và probe với nhiều trình tự genome khác nhau của chủng HPV đang cần phát hiện và các chủng HPV cịn lại. Các trình tự này được thảm khảo từ cơ sở dữ liệu Nucleotide (NCBI). Kiểm tra tính đặc hiệu của primer và probe với các trình tự E6, E7 và L1 của các chủng HPV16, 18 và 52 mà nhóm nghiên cứu đã phân tích được để xác định tính đặc hiệu của primer và probe với các chủng HPV đang lưu hành ở Việt Nam.
Từ dữ liệu tham khảo trong các bài báo[28, 33-34], trình tự genome của các chủng HPV trên cơ sở dữ liệu, trình tự các đoạn gen mà nhóm nghiên cứu phân tích đượcvà các phần mềm tin sinh kiểm tra,chúng tơi thiết kế được primer và probe cho
nhận biết HPV16 cho kết quả dương tính trên kênh HEXvà phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu ở vùng HPV16 E6-E7 [34]; primer và probe nhận biết HPV18 cho kết quả dương tính trên kênh Cy5 và phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu ở gen HPV18 L1 [33]; primer và probe nhận biết HPV33/52 cho kết quả dương tính trên kênh FAM và phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu ở gen HPV33/52 L1 [28]; primer và probe chứng nội kiểm (IC) cho kết quả dương tính trên kênh Cy5.5 và phát hiện đoạn trình tự đặc hiệu trên gen HMBS (Hydroxymethylbilane synthase) – là một gen quản gia nằm trên nhiễm sắc thể số 11 trong hệ genome người, mã hóa cho enzyme Hydroxymethylbilane synthase, enzyme này tham gia vào quá trình sinh tổng hơp protein Hem, thành phần có trong máu, tủy xương và gan. Cả 4 trình tự mồi sử dụng trong kỹ thuật realtime PCR đều khuếch đại sản phẩm có kích thước khơng quá 200bp.
2.2.1.2 Xác định tính đặc hiệu của primer và probe trong phản ứng Realtime PCR
Xác định tính đặc hiệu của primer và probe bao gồm hai bước sau:
(1)Thực hiện phản ứng realtime đơn cặp primer và probe: từng cặp primer và probe riêng lẻ.
(2) Thực hiện phản ứng realtime đa cặp primer và probe: trộn 4 cặp primer và probe.
Phản ứng Realtime PCR thực hiện trên máy Rotogen Q (Qiagen, CHLB Đức) với các thành phần phản ứng như sau: primer xuôi, primer ngược, probe tương ứng với từng cặp primer, QuantiFast Multiplex 2X Mastermix (Qiagen, CHLB Đức).
Sau khi thực hiện phản ứng realtimeđơn cặp primer và probe với các điều kiện khác nhau: nồng độ primer và probe, thay đổi một số loại enzyme khác nhau, chúng tôi đưa ra thành phần và nồng độ tương ứng của phản ứng Realtime PCR đơn cặp primer và probe ởbảng 2.1, thành phần và nồng độ tương ứng của phản ứng