Hình 3.21B
Hình 3.21C
Hình 3.21 Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập
(Hình 3.21 A, B, C tương ứng vớikênh HEX, Cy5 vàFAM)
Từ kết quả trên chúng tôi đưa ra kết luận: kỹ thuậtRealtime PCR xác định các chủng HPV16, 18 và 33/52 cho kết quả thống nhất giữa các lần thí nghiệm khác nhau do cùng 1 kỹ thuật viên thực hiện và do 3 kỹ thuật viên khác nhau .
3.3.3 Xác định độ đặc hiệu kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
Tiến hành kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe với 20 mẫu âm tính với chủng HPV16, 18, 33 và 52 của bộ mẫu chuẩn trong đó gồm 8 mẫu âm tính với HPV và 12 mẫu âm tính với 4 chủng HPV16, 18, 33 và 52 nhưng dương tính với các chủng HPV khác. Kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.12 và Hình 3.22.
Bảng 3.12.Kết quả thí nghiệm xác định độ đặc hiệu của phương pháp
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả (dương tính/âm tính /Ct) HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 1 B455 HPV45 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 23,9
2 A556 HPV35,68 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,2
3 A531 HPV56 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 24,0
4 A352 HPV31 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,3
5 A218 HPV39 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 31,0
6 B511 HPV68 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,4
7 A259 HPV56,62 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,9
8 A448 HPV62 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 23,5
9 A243 HPV66 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 24,4
10 B473 HPV66,81 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 24,7
11 A319 HPV68 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 24,8
12 A514 HPV11 Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,1
13 A1 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,0
14 A2 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,7
15 A3 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,1
16 A4 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 23,8
17 A5 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 23,5
18 A6 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 24,8
19 A7 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 26,8
20 A8 (*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính/ 25,9
21 Chứng dương HPV16, 18, 33/52 Dương tính /23,5 Dương tính /27,5 Dương tính /19,9 Âm tính 22 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
(*)
Mẫu âm tính với các chủng HPV
Hình 3.22A. HEX Hình 3.22B.Cy5
Hình 3.22C.FAM Hình 3.22D.Cy5.5
B455; A556; A531; A352; A218; B511; A259; A448 A243; B473; A319; A514; A1; A2; A3; A4; A5; A6 A7; chứng dương
Hình 3.22.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ đặc hiệu
(Hình 3.22A, B, C, D tương ứng với kênh HEX, Cy5, FAM và Cy5.5)
Chú thích: màu nâu tương ứng với chứng dương, các màu còn lại tương ứng với các mẫu âm tính với một trong bốn chủng hoặc cả 4 chủng HPV16, 18, 33 và 52
Phân tích kết quả trên cả 4 kênh đọc cho thấy cả 20 mẫu âm tính của bộ mẫu chuẩn đều cho kết quả âm tính trên các kênh HEX, Cy5và FAM (Bảng 3.12). Chứng tỏ cả 20 mẫu này đều âm tính với các chủng HPV16, 18, 33, 52 khi xác định bằng phương pháp mới, tỷ lệ các mẫu âm tính xác định bằng phương pháp mới xây dựng trên 20 mẫu âm tính của bộ mẫu chuẩn là 100%. Chứng dương, chứng âmvà cặp primer, probe IC (cho tín hiệu ở kênh Cy5.5) được sử dụng để kiểm soát chất lượng của kỹ thuật realtime PCR. Ở các kênh HEX (Hình 3.22A), Cy5 (Hình 3.22B) và FAM (Hình 3.22C) chỉ xuất hiện 1 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang điển hình của chứng dương, tương ứng với kết quả dương tính của chứng dương trên cả 3 kênh đọc đó, điều này chứng tỏ quá trình thực hiện phản ứng Realtime PCR đã bổ sung đầy đủ các thành phần cần thiết cho phản ứng. Cặp primer, probe IC nhận biết 1 đoạn trình tự trên gen HMBS (ln có mặt trong mẫu) nên ln cho kết quả dương tính trên kênh Cy5.5 khi phản ứng có mặt của mẫu, do đó khi phân
quang điển hình tương ứng với tất cả các mẫu thí nghiệm. Kết quả này chứng tỏ q trình thao tác thí nghiệm người thực hiện đã bổ sung đầy đủ mẫu vào tất cả các phản ứng. Chứng âm cho kết quả âm tính trên cả 4 kênh đọc chứng tỏ khơng có sự nhiễm chéo trong thao tác thí nghiệm.Từ đó, chúng tơi rút ra kết luận tỷ lệ kết quả âm tính xác định bằng kỹ thuật realtime PCR so với kết quả âm tính của mẫu chuẩn là 100%.
3.3.4 Xác định độ nhạycủa kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 18 và 33/52
Tiến hành kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe với 20 mẫu dương tính với ít nhất một trong các chủng cần phát hiện và mẫu này là mẫu thuộc bộ mẫu chuẩn của nghiên cứu. Gồm 8 mẫu dương tính với HPV16, 7 mẫu dương tính với HPV18 và 6 mẫu dương tính với HPV52 và 2 mẫu dương tính với HPV33. Kết quả thu được trình bày ở Bảng 3.13 và Hình 3.23.
Quan sát Hình 3.23A, B, C đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang sau mỗi chu kì của các mẫu dương tính là điển hình, kết quả được tổng kết lại ở Bảng 3.11 như sau: trong 20 mẫu dương tính của bộ mẫu chuẩn có 8 mẫu HPV16 cho kết quả dương tính ở kênh HEX, 7 mẫu HPV18 cho kết quả dương tính ở kênh Cy5 và 7 mẫu HPV33/52 cho kết quả dương tính ở kênh FAM. Tỷ lệ các mẫu dương tính xác định bằng phản ứng Realtime PCR trên 20 mẫu dương tính với 1 trong các chủng HPV16, 18, 33/52 của bộ mẫu chuẩn là 100%. Tỷ lệ mẫu dương tính với từng chủng HPV16, 18, 33/52 khi xác định bằng kỹ thuật realtime PCR trên các mẫu dương tính tương ứng đều là 100% (8/8 mẫu HPV16, 7/7 mẫu HPV18, 7/7 mẫu HPV33/52).Kênh Cy5.5 cho giá trị Ct tương đương giữa các mẫu, chứng tỏ thao tác thí nghiệm tra mẫu đã được thực hiện đầy đủ ở tất cả các phản ứng và không xuất hiện yếu tố ức chế đối với phản ứng PCR.Chứng âm cho kết quả âm tính ở cả 4 kênh đọc chứng tỏ khơng có sự nhiễm chéo trong q trình thao tác thí nghiệm.
Kết luận: tỷ lệ kết quả dương tính xác định bằng kỹ thuật Realtime PCR trong tổng số kết quả dương tính của bộ mẫu chuẩn là 100%.
Bảng 3.13.Kết quả thí nghiệm xác định độ nhạy của phương pháp
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 IC 1 A305 HPV16 Dương tính
/24,9 Âm tính Âm tính Dương tính /26,8 2 A435 HPV16 Dương tính
/23,1 Âm tính Âm tính Dương tính /25,2 3 A410 HPV16 Dương tính
/27,2 Âm tính Âm tính Dương tính /26,9 4 A445 HPV16 Dương tính
/27,9 Âm tính Âm tính Dương tính /23,9 5 B344 HPV16 Dương tính
/25,0 Âm tính Âm tính Dương tính /25,7 6 TEB064 HPV16 Dương tính
/26,3 Âm tính Âm tính Dương tính /26,4 7 TEB101 HPV16 Dương tính
/20,2 Âm tính Âm tính Dương tính /20,9 8 TEB094 HPV16, 18 Dương tính /34,1 Dương tính /25,5 Âm tính Dương tính /23,2 9 A147 HPV18 Âm tính Dương tính
/32,0 Âm tính Dương tính /23,1 10 A268 HPV18 Âm tính Dương tính
/29,1 Âm tính Dương tính /23,5 11 A264 HPV18 Âm tính Dương tính
/28,06 Âm tính Dương tính /24,27 12 B542 HPV18 Âm tính Dương tính
/28,41 Âm tính Dương tính /24,45 13 TEB068 HPV18 Âm tính Dương tính
/33,08 Âm tính Dương tính /24,09 14 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính /36,40 Dương tính /23,38 Dương tính /24,51 15 B557 HPV52 Âm tính Âm tính Dương tính
/23,46
Dương tính /23,37 16 A103 HPV52 Âm tính Âm tính Dương tính
/22,30
Dương tính /23,49 17 A424 HPV33, 52 Âm tính Âm tính Dương tính
/18,74
Dương tính /24,36 18 A458 HPV52 Âm tính Âm tính Dương tính
/21,34
Dương tính /23,77 19 B578 HPV52 Âm tính Âm tính Dương tính
/24,10
Dương tính /23,47 20 B206 HPV33 Âm tính Âm tính Dương tính
/21,75
Dương tính /25,92 21 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính