3.23A HEX Hình 3.23B Cy5 Hình 3.23C FAM Hình 3.23D Cy5.5
A305; A435; A410; A445; B344; TEB064; TEB101 A147; A268; A264; B542; TEB068; TEB094; B252 B557; A103; A424; A458; B578; B206
Hình 3.23.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm đánh giá độ nhạy
(Hình 3.23A, B, C, D tương ứng vớikênh HEX, Cy5, FAM vàCy5.5) Chú thích:
Màu tương ứng với các mẫu A305, A435, A410, A445, B344, TEB064, TEB101, TEB094 thuộc genotype HPV16
Màu tương ứng với các mẫu A147, A268, A264, B542, TEB068, TEB094, B252 thuộc genotype HPV18
Trong rất nhiều yếu tố nguy cơ của ung thư cổ tử cung thì HPV được coi là tác nhân liên quan mật thiết nhất. Do sự biến động di truyền của HPV giữa các khu vực khác nhau nên có rất nhiều nghiên cứu phát hiện HPV nói chung và phát hiện HPV bằng kỹ thuật multiplex Realtime PCR nói riêng[34][28][25][39];v.v… Tuy nhiên các nghiên cứu nói trên đã xây dựng phương pháp phát hiện được sự có mặt của các chủng HPV và đưa ra tỷ lệ nhiễm HPV ở từng khu vực.Trong một số nghiên cứu phát hiện HPV bằng kỹ thuật multiplex Realtime PCR khác có đưa ra đánh giá về giới hạn phát hiện của phương pháp thơng qua việc tính số bản copy thấp nhất mà kỹ thuật realtime PCR phát hiện đượcnhư nghiên cứu Daojun Yu (2012) [17] và William T Seaman (2010)[38] có đưa ra phương pháp phát hiện sự có mặt của các chủng HPV 6, 11, 16, 18 trong mẫu bệnh phẩm bằng kỹ thuật Realtime PCR với độ nhạy tương ứng là 101 – 102 copy/ phản ứng và 2x101 – 2x106 copy/ phản ứng. Từ đó có thể thấy so với các phương pháp phát hiện HPV cùng dựa trên kỹ thuật Realtime PCR thì phương pháp chúng tơi xây dựng được có độ nhạy cao hơn là 3 – 30 copy/phản ứng. Phương pháp của chúng tơi có độ nhạy cao hơn do các nguyên nhân sau: primer và probe thiết kế là hoàn toàn đặc hiệu, nhận biết trình tự có tính phân biệt cao giữa các chủng HPV và ko có cấu trúc hairpin; Thành phần của kỹ thuật realtime PCR là hợp lý.
Kit Cobas 4800HPV, Roche (FDA) – kit xét nghiệm HPV nguy cơ cao gây ung thư cổ tử cung dựa trên kỹ thuật realtime PCR cũng đưa ra đánh giá về giới hạn phát hiện của kit đối với các chủng HPV16, 18, 33/52 tương ứng là 300, 300, 2400 copy/ml trong mẫu dịch quét cổ tử cung.Trong nghiên cứu này, cứ 200ul dịch quét cổ tử cung tách chiết bằng kit tách chiết ADN của Roche thu được 50ul ADN, tương ứng với nồng độ 1 copy/ul trong ADN là 250 copy/mldịch tách chiết, giới hạn phát hiện của HPV16, 18, 33/52 là 1, 1, 10/10 copy/ul dịch tách chiết thì có 250, 250, 2500/2500 copy/ml dịch tách chiết, kết quả thu được cũng tương tự với kết quả của kit.
Phương pháp phát hiện HPV đang xây dựng ngồi việc có độ nhạy cao hơn các nghiên cứu phát hiện HPV với cùng kỹ thuật realtime PCR và độ nhạy tương đương với kit thương mại Roche cịn có ưu điểm:
+ Phương pháp phát hiện HPV 16, 18, 33/52 có sử dụng cặp mồi chứng nội kiểm (IC) và chứng dương kiểm soát chất lượng của xét nghiệm: sử dụng cặp
ức chế trong kỹ thuật realtime PCR; đồng thời sử dụng chứng dương để kiểm sốt các thao tác thí nghiệm ở bước thực hiện kỹ thuật realtimePCR.
+Tiếp tục phát triển phương pháp cho các mục đích nghiên cứu khác: khác với các kít thương mại phát hiện HPV bằng kỹ thuật realtime PCR thường phụ thuộc vào thiết bị, thành phần sinh phẩm như kit cobas 4800 Roche chỉ sử dụng trên hệ thiết bị kín và sinh phẩm của hãng, phương pháp này là một hệ mở có thể bổ sung thêm các cặp mồi và probe phát hiện các chủng Lr-HPV và Hr-HPV khác vào trong cùng phản ứng realtime PCR hoặc trong một phản ứng realtime PCR riêng biệt khác với thành phần tương tự như trong kỹ thuật realtime PCR phát hiện HPV16, 18, 33/52. Do đó có thể tiếp tục phát triển phương pháp này để phát hiện các chủng HPV tùy thuộc vào mục đích nghiên cứu, xét nghiệm thực tiễn, ví dụ như phát hiện các chủng nguy cơ cao có trong thành phần của vắc xin 9 giá, phát hiện các chủng HPV nguy cơ thấp, gây mụn cóc sinh dục như HPV6, 11, v.v…Phương pháp này không chỉ được sử dụng để xác định nguy cơ ung thư cổ cung cho phụ nữ mà cịn có thể tiếp tục phát triển để xác định nguy cơ một số bệnh khác cũng do HPV gây ra như: mụn cóc sinh dục, sùi mào gà, ung thư dương vật.
+ Ngoài ra, phương pháp này có những ưu điểm của kỹ thuật multiplex realtime PCR nói chung là nhanh, độ chính xác cao, phát hiện một lúc được nhiều tác nhân, giá thành rẻ hơn các Kít thương mại đang sử dụng để sàng lọc HPV trên thị trường, chi phí cho 1 xét nghiệm sàng lọc các chủng HPV16, 18, 33/52 theo phương pháp chúng tôi xây dựng là 160.000 VND tiết kiệm hơn rất nhiều so với chi phí cho 1 xét nghiệm sàng lọc HPV với Kit Cobas 4800 HPV, Roche (FDA) hiện là 750.000 VND.
KẾT LUẬN
Thiết kế thành công phương pháp phát hiện các chủngHPV16, 18 và 33/52 bằng kỹ thuật Realtime PCR có sử dụngchứng nội kiểm (IC)và chứng dương với giới hạn phát hiện các tác nhân tương ứng là 3, 3 và 30/30 copy/phản ứng.
Xác định các chỉ tiêu thẩm định kỹ thuật Realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52:
Độ chính xác: phản ứng multiplexRealtime PCR nhóm thiết kế cho kết quả thống nhất với kết quả của bộ mẫu chuẩn được xác định trước đó.
Độ chụm: phản ứng multiplex Realtime PCR cho kết quả thống nhất giữa các xét nghiệm riêng lẻ cũng như giữa các kỹ thuật viên khác nhau.
Độ đặc hiệu của phản ứng multiplex Realtime PCR là 100%. Độ nhạycủa phản ứng multiplex Realtime PCR là 100%.
KIẾN NGHỊ
Từ thực tế quá trình nghiên cứu chúng tơi đưa ra một số kiến nghị sau:
1. Tiếp tục phát triển phương pháp để có thể phát hiện được các chủng HPV nguy cơ cao khác và cả các chủng HPV nguy cơ thấp.
2. Đánh giá phương pháp với các tác nhân khác HPV cũng có mặttrên đường sinh dục: lậu, giang mai, v.v và tác nhân HPV thu được ở khu vực khác trên cơ thể: da, tay chân, niêm mạc miệng, hậu môn; nước tiểu v.v…
3. Đánh giá phương pháp trên quần thể mẫu rộng hơn và nhiều hơn về số lượng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
1. Dung N. T. N. D. (2004), "Khảo sát sự liên quan giữa mẹ nhiễm HPV và con bệnh u nhú thanh quản," Thời sự Y Dược học, 4, 4.
2. Hiếu N. T. H. (2004), "Tần xuất nhiễm HPV ở phụ nữ thành phố Hồ Chí Minh,"
Thời sự Y Dược học, 4, 5.
3. Trung N. T. H. (2007), "HPV và tổn thương cổ tử cung," Y Học TP. Hồ Chí Minh, 3, 4.
4. Vân P. H. V. (2009), "PCR và real-time PCR: Các vấn đề cơ bản và các áp dụng thường gặp. Sinh học phân tử," Nhà xuất bản Y học, 27.
5. Văn T. T. V. (2010), "PCR và một số kỹ thuật Y sinh học phân tử. Sinh học phân tử," Nhà xuất bản Y học, 68.
Tài liệu tiếng Anh
6. A B.-P. (2009), "Molecular Signature of HPV-Induced Carcinogenesis: pRb, p53 and Gene Expression Profiling," Current genomics, 10, 9.
7. Anco M. B. K., Wim Q., Leen-J.D (2005), "Molecular diagnosis of human papillomavirus (HPV) infections," Journal of Clinical Virology, 32, 9.
8. Bao Y.P. S. J. S., Qiao Y.L., ACCPAB members (2008), "Human papillomavirus type distribution in women from Asia: a meta-analysis," International Journal of
Gynecologycal cancer, 18, 10.
9. Bernard H.U. B. R. D., de Villiers E.M, et al. (2010), "Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189 PV types and prodương tínhal of taxonomic amendments," Virology, 401, 10.
10. Boccardo E L. A. V. L. (2010), "The role of inflammation in HPV carcinogenesis,"
Carcinogenesis, 31, 8.
11. Bodaghi S. W. L. V., Roby G., Ryder C., et al (2010), "Could human papillomaviruses be spread through blood?," Journal of Clinical Microbiology, 43, 7.
12. Bontkes H. J., T.D. deGruijl, J.M.Walboomers, J.T.Schiller, J. Dillner, T.J. Helmerhorst, R.H.Verheijen, R.J.Scheter, and C.J.Meijer (1999), "Immune responses again human papillomavirus (HPV) type 16 virus-like particles in a cohort study of women with cervical intraepithelial neoplasia. II. Systemic but not local IgA responses correlate with clearance of HPV-16," J.Gen. Virol, 80, 9. 13. Burchell AN W. R., de Sanjose S, FrancoEL (2006), "Chapter 6 epiderniology and
transmission dynamics of genital HPV infection vaccine 2006," Vaccine, 24, 10. 14. Burd E. M. (2003), "Human papillomavirus and cervical cancer," Clin Microbiol
Rev, 16, 1-17.
15. Chan P. K., M.Y. Chan, W.W.Li, D.P.Chan, J.L.Cheung, and A.F.Cheung (2001), "Association of human beta-herpesvirus with the development of cervical cancer; by standers or cofactor?," J.Clin. Pathol, 54, 6.
16. Clifford G. F. S., Diaz M., Munoz N., Villa L.L (2006), "Chapter 3: HPV type- distribution in women with and without cervical neoplastic diseases," Vaccine, 24, 9.
17. Daojun Yu Y. C., Shenghai Wu, Baohong Wang, Yi-Wei Tang, Lanjuan Li (2012), "Simultaneous Detection and Differentiation of Human Papillomavirus Genotypes 6, 11, 16 and 18 by AllGlo Quadruplex Quantitative PCR," PLoS One, 11,
18. De Villiers E.M. F. C., Broker T.R., Bernard H.U., zur Hausen H (2004), "Classification of papillomaviruses," Virology, 324, 11.
19. Doorbar J. (2006), "Molecular biology of human papillomavirus infection and cervical cancer," Clin Sci (Lond), 110, 525-541.
20. EM B. (2003), "Human papillomavirus and cervical cancer," Clinical Microbiology
Review, 16, 17.
21. Ferlay J., Shin H. R., Bray F., Forman D., Mathers C. and Parkin D. M. (2010), "Estimates of worldwide burden of cancer in 2008: GLOBOCAN 2008," Int J
Cancer, 127, 2893-2917.
22. H Z. H. (2011), "Vaccines: what remains to be done?," Vaccine, 10, 3.
23. Hebner C. M. and Laimins L. A. (2006), "Human papillomaviruses: basic mechanisms of pathogenesis and oncogenicity," Rev Med Virol, 16, 83-97.
24. Ishizaki A., Matsushita K., Hoang H. T., Agdamag D. M., Nguyen C. H., Tran V. T., et al. (2013), "E6 and E7 variants of human papillomavirus-16 and -52 in Japan, the Philippines, and Vietnam," J Med Virol, 85, 1069-1076.
25. Jenkins A., Allum A. G., Strand L. and Aakre R. K. (2013), "Simultaneous detection, typing and quantitation of oncogenic human papillomavirus by multiplex consensus real-time PCR," J Virol Methods, 187, 345-351.
26. Lehoux M., D'Abramo C. M. and Archambault J. (2009), "Molecular mechanisms of human papillomavirus-induced carcinogenesis," Public Health Genomics, 12, 268-280.
27. Ly Thi-Hai Tran L. T. T., Thanh Cong Bui, Dung Thi-Kieu Le, Alan G Nyitray, Christine M Markham, Michael D Swartz, Chau Bao Vu-Tran and Lu-Yu Hwang (2015), "Risk factors for high-risk and multi-type Human Papillomavirus infections among women in Ho Chi Minh City, Vietnam: A crosssectional study," BMC
Women's Health,
28. Martin Moberg I. G., and Ulf Gyllensten (2003), "Real-Time PCR- Based system for Simultaneous Quantification of Human Papillomavirus Types Associated with High Risk of Cervival Cancer," Journal of clinical microbiology, 41, 8.
29. Munoz N., Bosch F. X., de Sanjose S., Herrero R., Castellsague X., Shah K. V., et al. (2003), "Epidemiologic classification of human papillomavirus types associated with cervical cancer," N Engl J Med, 348, 518-527.
30. Munoz N., Castellsague X., de Gonzalez A. B. and Gissmann L. (2006), "Chapter 1: HPV in the etiology of human cancer," Vaccine, 24 Suppl 3, S3/1-10.
31. Nicol A.F. N. G. J., Dillner J (2010), "A summary of the 25th International Papillomavirus Conference 2009: Vaccines, screening, epidermiology and
32. Parkin D. M., Bray F., Ferlay J. and Pisani P. (2005), "Global cancer statistics, 2002," CA Cancer J Clin, 55, 74-108.
33. Rachel L. Winer T. G. H., Long Fu Xi, Kathrin U. Jansen, James P. Hughes, Qinghua Feng, Carolee Welebob, Jesse Ho, Shu-Kuang Lee, Joseph J. Carter, Denise A. Galloway, Nancy B. Kiviat, and Laura A. Koutsky (2009), "Quantitative human papilloma virus 16 and 18 levels in incident infections and cervical lesion development," Journal of Medical Virology, 81, 8.
34. Sahiner F K. A., Yapar M, Şener K, Dede M, Gumral R (2014), "Detection of major HPVs by a new multiplex real-time PCR assay using type-specific primers,"
Journal of Microbiological Method, 97, 7.
35. Sydney (2011), "Verification and Validation Symposium Event - National Institude of Hygiene and Epidemiology,"
36. T. C. Dung F. R., N. Becker, P. T. Huong, N. V. Trang, L. M. Tan, P. V. Hung, and N. T. Hien "Prevalence of human papillomavirus (HPV) infection and genotype distribution among women in Vietnam: a meta-analysis," submitted 2015,
37. Tham Chi Dung N. V. T., Frank Roesl, Pham Ngoc Hung, Vu Ba Quyet, Le Quang Thanh, Huynh Xuan Nghiem, Tran Thi Mai Hung, Luong Minh Tan, Nguyen Phuong Anh and Nguyen Tran Hien "Prevalence of high-risk Human Papillomavirus infection among women aged 18-45 in two major cities in Vietnam," submitted 2015,
38. William T Seaman E. A., Marion Couch, Erna M Kojic, Susan Cu-Uvin, Joel Palefsky, Allison M Deal and Jennifer Webster-Cyriaque (2010), "Detection and quantitation of HPV in genital and oral tissues and fluids by real time PCR,"
Virology Journal, 194,
39. Yiqun Liao Y. Z., Qiwei Guo, Xiaoting Xie, Ena Luo, Jian Li,and Qingge Li (2013), "Simultaneous Detection, Genotyping, and Quantification of Human Papillomaviruses by Multicolor Real-Time PCR and Melting Curve Analysis,"
Journal of Clinical Microbiology. 2013 Feb; 51(2): 429–435., 2, 7.
Tài liệu Internet
40. HPV Information Centre (2015), VietNam: Human papilomavirus and Related Diseases, Sumamary Report 2015
http://www.hpvcentre.net/statistics/reports/VNM.pdf (20/12/2015),
41. HPV Information Centre (2015), World: Human papilomavirus and Related Diseases, Sumamary Report 2014.
http://www.hpvcentre.net/statistics/reports/XWX.pdf (20/12/2015), 42. http://en.wikipedia.org/wiki/HPV_vaccines, (20/12/2015),"
43. WHO, Human papillomavirus laboratory manual, first edition 2009
http://www.who.int/immunization/hpv/learn/hpv_laboratory_manual__who_ivb_20 09_2010.pdf (20/12/1015)
44. https://www.google.com/webhp?sourceid=chrome-instant&ion=1&espv=2&ie=UT F -8#q=calculate%20copy%20number
PHỤ LỤC
Phụ lục 1: Danh sách các mẫu ADN HPVdùng cho nghiên cứu
*kết quả xác định bằng bộ Kit Cobas 4800 Roche (FDA)-PTN MDVX
Hr-HPV: HPV31, 33, 35, 39, 45, 51, 52, 56, 58, 59, 66, 68; Âm tính: âm tính với các chủng HPV
STT Tên mẫu Type/Ct * STT Tên mẫu Type/Ct*
1 A248 HPV16/27,3 45 B420 HPV51; HPV52/30,8 2 B344 HPV16; 44; 70 46 B422 HPV 52/30,0;HPV58 3 B203 HPV16 47 B206 HPV33 4 B144 HPV16 48 A319 HPV68/26,1 5 B151 HPV16; 52 49 A336 HPV39/30,8 6 TEB094 HPV16;18 50 A352 HPV31/29,1 7 TEB101 HPV16 51 A243 HPV66/22,6 8 TEB064 HPV16 52 A259 HPV56/26,7;HPV62 9 TEB020 HPV16 53 A127 HPV51/36,2 10 A445 HPV16/34,0;HPV39/26,3 54 A218 HPV39/38,7 11 A435 HPV16/26,8 55 A448 HPV62/39,0 12 A410 HPV16/31,9; HPV62; 70 56 A456 HPV39; HPV56/22,4 13 A412 HPV16/25,5 57 A504 HPV51/23,9 14 A301 HPV16/37,2 58 A514 HPV11 15 A305 HPV16/29,4 59 A531 HPV56/31,7 16 B464 HPV16/40.3;HPV59/37,4 60 A539 HPV43/38,8 17 B522 HPV16/37,9 61 A556 HPV35;HPV68/29,4 18 A147 HPV18/35,1 62 B455 HPV45/28,5 19 A149 HPV18/27,8 63 B129 HPV51, 58 20 B347 HPV18 64 B473 HPV66/22,4; 81 21 B252 HPV18;52 65 B305 HPV39 22 A549 HPV18/30,0 66 B511 HPV68/28,9 23 B149 HPV18 67 A615 HPV51/39,9 24 B143 HPV18 68 A646 HPV81/28,0 25 TEB067 HPV18 69 B367 HPV51 26 TEB068 HPV18 70 A108 Hr-HPV/38.8 27 TEB052 HPV18 71 A232 Hr-HPV/37.9 28 TEB055 HPV18 72 A318 Hr-HPV/33.8 29 A432 HPV18/36,2 73 A363 Hr-HPV/38.2 30 A264 HPV18/29,5 74 A407 Hr-HPV/31.7 31 A268 HPV18/30,2 75 A520 Hr-HPV/39.2 32 B604 HPV18/36,9 76 A540 Hr-HPV/35.4 33 B641 HPV18/38,7;HPV82/39,1 77 A668 Hr-HPV/34.9 34 B542 HPV18/33,3 78 B438 Hr-HPV/36.4 35 A103 HPV52/33,9;HPV58 79 B501 Hr-HPV/38.2 36 A424 HPV33/23,4;HPV52 80 B658 Hr-HPV/36.7 37 A438 HPV52/37,6 81 A1 Âm tính 38 B557 HPV52/38,5 82 A2 Âm tính 39 B578 HPV52/31,3;HPV70 83 A3 Âm tính 40 A458 HPV31;HPV52/27,1 84 A4 Âm tính 41 A468 HPV52/36,5 85 A5 Âm tính 42 A534 HPV43;66;HPV52/40,0 86 A6 Âm tính 43 B113 HPV52 87 A7 Âm tính 44 A557 HPV52/37,0; HPV62 88 A8 Âm tính
Phụ lục 2: Kết quả giải trình tự trình đích
Kết quả giải trình tự HPV16E6-E7 (A248E6-E7)
GGCGGGAGTTTTATGCACCAAAAGAGAACTGCAATGTTTCAGGACCCACAGGAGCG ACCCAGAAAGTTACCACAGTTATGCACAGAGCTGCAAACAACTATACATGATATAA TATTAGAATGTGTGTACTGCAAGCAACAGTTACTGCGACGTGAGGTATATGACTTT GCTTTTCGGGATTTATGCATAGTATATAGAGATGGGAGTCCATATGCTGTATGTGA TAAATGTTTAAAGTTTTATTCTAAAATTAGTGAGTATAGACTTTATTGTTATAGTT TGTATGGAACAACATTAGAACAGCAATACGACAAACCGTTGTGTGATTTGTTAATT AGGTGTATTAACTGTTGCAAGCCACTGTGTCCTGAAGAAAAGCAAAGACATCTGGA CAAAAAGCAAAGATTCCATAATATAAGGGGTCGGGGGACTGCTGTATGTCTGGATT GTTTGCAATTCTCTAGAGCAGCTAAAGAAGTCCGCTTGTATTCATGCCTGTATAGA CTCGACCGTTTTTCAGAATATATGTTAGATTTGCAACCAGAGACAACTGATCTCTA CTGTTATGAGCAATTAAATGACAGCTCAGAGGAGGAAGATGAAATAGATGGTCCAG CTGGACAAGCAGAACCGGACAGAGCCCATTACAATATTGTAACCTTTTGTTGCAAG TGTGACTCTACGCTTCGGTTGTGCGTACAAAGCACACACGTAGACATTCGTACTTT GGAAGACCTGTTAATGGGCACACTAGGAATTGTGTGCCCCATCTGTTCTCAGAAAC CATAATCTACCATGGCTGATCCTGCAGGTACCAATGGGGAAGAGGTCGGAATTAGG GTCCA
Kết quả giải trình tự HPV18L1 (A149L1)
TATCACCCACAGCCCCTGCCTCTACACAGTATATTGGTATACATGGTACACATTAT TATTTGTGGCCATTATATTATTTTATTCCTAAGAAACGTAAACGTGTTCCCTATTT TTTTGCAGATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCT TCTGTGGCAAGAGTTGTAAATACCGATGATTATGTGACTCGCACAAGCATATTTTA TCATGCTGGCAGCTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTG CAGGTGGTGGCAATAAGCAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTA TTTAGGGTGCAGTTACCTGACCCAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTA TAATCCTGAAATATCCTGATTATTTACAAATGTCTGCAGATCCTTATGGGGATTCC ATGTTTTTTTGCTTACGGCGTGAGCAGCTTTTTGCTAGGCATTTTTGGAATAGAGC AGGTACTATGGGTGACACTGTGCCTCAATCCTTATATATTAAAGGCACAGGTATGC GTGCTTCACCTGGCAGCTGTGTGTATTCTCCCTCTCCAAGTGGCTCTATTGTTACC TCTGACTCCCAGTTGTTTAATAAACCATATTGGTTACATAAGGCACAGGGTCATAA CAATGGTGTTTGCTGGCATAATCAATTATTTGTTACTGTGGTAGATACCACTCGCA GTACCAATTTAACAATATGTGCTTCTACACAGTCTCCTGTACCTGGGCAATATGAT GCTACCAAATTTAAGCAGTATAGCAGACATGTTGAGGAATATGATTTGCAGTTTAT TTTTCAGTTGTGTACTATTACTTTAACTGCAGATGTTATGTCCTATATTCATAGTA TGAATAGCAGTATTTTAGAGGATTGGAACTTTGGTGTTCCCCCCCCGCCAACTACT AGTTTGGTGGATACATATCGTTTTGTACAATCTGTTGCTATTACCTGTCAAAAGGA TGCTGCACCGGCTGAAAATAAGGATCCCTATGATAAGTTAAAGTTTTGGAATGTGG ATTTAAAGGAAAAGTTTTCTTTAGACTTAGATCAATATCCCCTTGGACGTAAATTT TTGGTTCAGGCTGGATTGCGTCGCAAGCCC
Kết quả giải trình tự HPV52L1 (B578L1) TAGTGAGGCCACTGTGTACCTGCCTCCTGTACCTGTCTCTAAGGTTGTAAGCACTGAT GAGTATGTGTCTCGCACAAGCATCTATTATTATGCAGGCAGTTCTCGATTACTAACAG TAGGACATCCCTATTTTTCTATTAAAAACACCAGTAGTGGTAATGGTAAAAAAGTTTT AGTTCCCAAGGTGTCTGGCCTGCAATACAGGGTATTTAGAATTAAATTGCCGGACCCT AATAAATTTGGTTTTCCGGATACATCTTTTTATAACCCAGAAACCCAAAGGTTGGTGT GGGCCTGTACAGGCTTGGAAATTGGTAGGGGACAGCCTTTAGGTGTGGGTATTAGTGG GCATCCTTTATTAAACAAGTTTGATGATACTGAAACCAGTAACAAATATGCTGGTAAA CCTGGTATAGATAATAGAGAATGTTTATCTATGGATTATAAGCAGACTCAGTTATGCA TTTTAGGATGCAAACCTCCTATAGGTGAACATTGGGGTAAGGGAACCCCTTGTAATAA TAATTCAGGAAATCCTGGGGATTGTCCTCCCCTACAACTCATTAACAGTGTAATACAG GATGGGGACATGGTAGATACAGGATTTGGTTGCATGGATTTTAATACCTTGCAAGCTA GTAAAAGTGATGTGCCCATTGATATATGTAGCAGTGTATGTAAGTATCCAGATTATTT GCAAATGGCTAGCGAGCCATATGGTGACAGTTTGTTCTTTTTTCTTAGACGTGAGCAA ATGTTTGTTAGACACTTTTTTAATAGGGCTGGTACCTTAGGTGACCCTGTGCCAGGTG ATTTATATATACAAGGGTCTAACTCTGGCAATACTGCCACTGTACAAAGCAGTGCTTT TTTTCCTACTCCTAGTGGTTCTATGGTAACCTCAGAATCCCAATTATTTAATAAACCG TACTGGTTACAACGTGCGCAGGGCCACAATAATGGCATATGTTGGGGCAATCAGTTGT TTGTCACAGTTGTGGATACCACTCGTAGCACTAACATGACTTTATGTGCTGAAGTTAA AAAGGAAAGCACATATAAAAATGAAAATTTTAAGGAATACCTTCGTCATGGCGAGGAA TTTGATTTACAATTTATTTTTCAATTGTGCAAAATTACATTAACAGCTGATGTTATGA CATACATTCATAAGATGGATGCCACTATTTTAGAGGACTGGCAATTTGGCCTTACCCC ACCACCGTCTGCATCTTTGGAGGACACATACAGATTTGTAACTTCTACTGCTATAACT TGTCAAAAAAACACACCACCTAAAGGAAAGGAAGATCCTTTAAAGGACTATATGTTTT GGGAGGTGGATTTAAAAGAAAAGTTTTCTGCAGATTTAGATCAGTTTCCTTTAGGTAG GAAGTTTTTGTTAC
Phụ lục 3: Kết quả giải trình tự plasmid
Kết quả giải trình tự plasmid mang đoạn chèn HPV16 E6-E7 với cặp mồi T7-
SP6GCAGGCGGCCGCGAATTCACTAGTGATTCATTACATCCCGTACCCTCTTCCCCATTGG TACCTGCAGGATCAGCCATGGTAGATTATGGTTTCTGAGAACAGATGGGGCACACAATTCC TAGTGTGCCCATTAACAGGTCTTCCAAAGTACGAATGTCTACGTGTGTGCTTTGTACGCAC AACCGAAGCGTAGAGTCACACTTGCAACAAAAGGTTACAATATTGTAATGGGCTCTGTCCG GTTCTGCTTGTCCAGCTGGACCATCTATTTCATCTTCCTCCTCTGAGCTGTCATTTAATTG CTCATAACAGTAGAGATCAGTTGTCTCTGGTTGCAAATCTAACATATATTCATGCAATGTA GGTGTATCTCCATGCATGATTACAGCTGGGTTTCTCTACGTGTTCTTGATGATCTGCAACA AGACATACATCGACCGGTCCACCGACCCCTTATATTATGGAATCTTTGCTTTTTGTCCAGA TGTCTTTGCTTTTCTTCAGGACACAGTGGCTTTTGACAGTTAATACACCTAATTAACAAAT CACACAACGGTTTGTTGTATTGCTGTTCTAATGTTGTTCCATACAAACTATAACAATAATG TCTATACTCACTAATTTTAGAATAAAACTTTAAACATTTATCACATACAGCATATGGACTC CCATCTCTATATACTATGCATAAATCCCGAAAAGCAAAGTCATATACCTCACGTCGCAGTA ACTGTTGCTTGCAGTACACACATTCTAATATTATATCATGTATAGTTGTTTGCAGCTCTGT GCATAACTGTGGTAACTTTCTGGGTCGCTCCTGTGGGTCCTGAAACATTGCAGTTCTCTTT TGGTGCATAAAATGTCTGCTTTTATACTAACCGGTTTCGGTTCAACCGATTTCAATCGAAT TCCCGCGGCCGCCATGGCGGCCGGGAGCATGCGACGTCGGGCCCAATTCGCCCTATAGTGA GTCGTATTACAATTCACTGGGCCGTC
Kết quả giải trình tự plasmid mang đoạn chèn HPV18L1 với cặp mồi M13
GAGCAATGCTTTTTTATAATGCCAACTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCCGCGGCCCCCACCC TTCACCATGTGCCTGTATACACGGGTCCTGATATTACATTACCATCTACTACCTCTGTATG GCCCATTGTATCACCCACAGCCCCTGCCTCTACACAGTATATTGGTATACATGGTACACAT TATTATTTGTGGCCATTATATTATTTTATTCCTAAGAAACGTAAACGTGTTCCCTATTTTT TTGCAGATGGCTTTGTGGCGGCCTAGTGACAATACCGTATATCTTCCACCTCCTTCTGTGG CAAGAGTTGTAAATACCGATGATTATGTGACTCGCACAAGCATATTTTATCATGCTGGCAG CTCTAGATTATTAACTGTTGGTAATCCATATTTTAGGGTTCCTGCAGGTGGTGGCAATAAG CAGGATATTCCTAAGGTTTCTGCATACCAATATAGAGTATTTAGGGTGCAGTTACCTGACC CAAATAAATTTGGTTTACCTGATACTAGTATTTATAATCCTGAAACACAACGTTTAGTGTG GGCCTGTGCTGGAGTGGAAATTGGCCGTGGTCAGCCTTTAGGTGTTGGCCTTAGTGGGCAT CCATTTTATAATAAATTAGATGACACTGAAAGTTCCCATGCCGCCACGTCTAATGTTTCTG AGGACGTTAGGGACAATGTGTCTGTAGATTATAAGCAGACACAGTTATGTATTTTGGGCTG