Hình 3.13A. Giếng 1-6: plasmid, M: thang chuẩn 1kb Hình 3.13B. Giếng 1-6:kiểm tra plasmid với cặp primer M13
(Giếng 7: chứng âm, M: Thang chuẩn 0.1-2Kb)
Vector Dtopo Pentry có kích thước 2580bp khi mang đoạn chèn 1606bp có kích thước 4186bp. Điện di plasmid sau tinh sạch cho kết quả dương tính với băng
kích thước >4Kb (giếng 1-6 Hình 3.13A), kiểm tra lại plasmid với cặp primer của vector cũng cho băng với kích thước khoảng 2Kb (giếng 1-6 Hình 3.13B), chứng tỏ 6 mẫu plasmid sau tinh sạch đều mang đoạn chèn đủ điều kiện để làm chứng dương cho kỹ thuật realtime PCR.
Sau khi tiến hành nhân dòng thu được 3 plasmid mang đoạn chèn A248- HPV16E6-E7; 6 plasmid mang đoạn chèn A149-HPV18L1; 6 plasmid mang đoạn chèn B578-HPV52L1. Các plasmid này có thể sử dụng làm chứng dương cho phản ứng Realtime PCR và dùng để xác định độ nhạy cho phương pháp.
3.2.3 Xác định giới hạn phát hiện củakỹ thuật Realtime PCR
Plasmid mang đoạn chèn HPV16E6-E7, HPV18L1 và HPV52L1 sau khi tinh sạch được tiến hành đo OD để xác định nồng độ, từ đó tính được số bản copy của plasmid như sau:
Plasmid A149 – HPV18L1 (OD = 189,65ng/ul) chứa 3.8x1010 copy/ul Plasmid B578 – HPV52L1 (OD = 160,42 ng/ul) chứa 3x1010 copy/ul Plasmid A248 – HPV16E6-E7 (OD = 220,75ng/ul) chứa 5.2x1010 copy/ul Chứng dương là hỗn hợp của 3 Plasmid: A248 mang đoạn chèn HPV16E6- E7 nhận biết bởi cặp primer phát hiện HPV16 cho tín hiệu ở kênh HEX; A149mang đoạn chèn HPV18L1 nhận biết bởi cặp primer phát hiện HPV18 cho tín hiệu ở kênh Cy5; B578 mang đoạn chèn HPV52L1 nhận biết bởi cặp primer phát hiện HPV33/52cho tín hiệu ở kênh FAM.
Xác định giới hạn phát hiện của kỹ thuật multiplex Realtime PCR ở các nồng độ chứng dương sau 105, 103,102, 101,100 copy/ul. Kết quả trình bày ở Bảng 3.6 và Hình 3.14.
Bảng 3.6. Kết quảkỹ thuậtRealtime PCR đa cặp primer và probe với chứng dương
STT Nồng độ chứng dương copy/ ul Kết quả/giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV52 1 10^5 Dương tính /19,9 Dương ính /20,5 Dương tính /18,1 2 10^3 Dương tính /26,3 Dương tính /27,1 Dương tính /24,8 3 10^2 Dương tính /29,8 Dương tính /30,9 Dương tính /28,5 4 10^1 Dương tính /33,3 Dương tính /33,1 Dương tính /31,6 5 10^0 Dương tính /35,8 Dương tính /36,2 Âm tính
Hình 3.14A Hình 3.14B Hình 3.14C Hình 3.14D Hình 3.14E Hình 3.14F 105; 103; 102; 101; 100
Hình 3.14. Kết quả kỹ thuật Realtime PCR đa cặp primer và probe với chứng
dươngtrên kênh HEX, Cy5 vàFAM
Hình 3.14A, C, E. Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang trên kênh HEX, Cy5 vàFAM Hình 3.14B, D, F. Đường chuẩn của kỹ thuật realtime PCR trên kênh HEX, Cy5 vàFAM
HEX
Cy5
Kết quả phân tích trên kênh HEXtrong Bảng 3.6 cho thấy ở tất cả các nồng độ của chứng dương đều cho kết quả dương tính, tương ứng với 5 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang trong Hình 3.14A. Giá trị Ct ở các nồng độ từ cao đến thấp có sự tuyến tính, khi giảm nồng độ 10 lần sau mỗi bậc pha lỗng thì giá trị Ct giảm xuống trung bình 3.2 Ct, giá trị Ct ở các nồng độ pha loãng đều dao động trên đường chuẩn (Hình 3.14B). Từ kết quả trên kênh HEXxác định được nồng độ thấp nhất của chứng dương HPV16 mà phản ứng Realtime PCR có thể phát hiện được là 10^0copy/ul, tương ứng với thể tích 3ul mẫu trong mỗi phản ứng Realime PCR thì có 3 bản copy của plasmid, hay có thể phát hiện sự có mặt của tác nhân HPV16 trong kỹ thuật realtime PCR chỉ với 3 bản copy.
Kết quả phân tích trên kênh Cy5 ở Bảng 3.6 và Hình 3.14C, 3.13D cũng tương tự như ở kênh HEX. Rút ra kết luận là có thể phát hiện sự có mặt của tác nhân HPV18 trong kỹ thuật realtime PCR chỉ với 3 bản copy.
Kết quả phân tích trên kênh FAMởBảng 3.6 chỉ ra rằng tất cả các nồng độ của chứng dương đều cho kết quả dương tính, trừ nồng độ 100 copy/ul thể hiện qua 4 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang điển hình trong Hình 3.14E. Giá trị Ct ở các nồng độ từ cao đến thấp có sự tuyến tính, khi giảm nồng độ 10 lần sau mỗi bậc pha lỗng thì giá trị Ct giảm xuống trung bình 3.2 Ct, các giá trị Ct tương ứng với từng bậc pha loãng cũng giao động quanh đường chuẩn (Hình 3.14F). Từ kết quả trên kênh FAM xác định được nồng độ thấp nhất của chứng dương HPV33/52 mà phản ứng Realtime PCR có thể phát hiện được là 10^1 copy/ul, tương ứng với thể tích 3ul mẫu trong mỗi phản ứng Realime PCR thì có 30 bản copy của plasmid, hay có thể phát hiện sự có mặt của tác nhân HPV33/52 trong phản ứng Realtime PCR chỉ với 30 bản.
Từ đây chúng tôi đưa ra đánh giá về giới hạn phát hiện của kỹ thuật realtime PCR như sau: kỹ thuật realtime PCR phát hiện sự có mặt của tác nhân HPV16, HPV18, HPV33/52 với số bản copy trong mỗi phản ứng tương ứng như sau: 3, 3, 30/30 copy/phản ứng và khả năng phát hiệncủa phương pháp với tác nhân HPV16 và HPV 18 tuyến tính trong khoảng 3x100đến 3x105 copy/phản ứng, với tác nhân HPV33/52 tuyến tính trong khoảng 3x101 đến 3x105 copy/phản ứng.
3.3 Thẩm định phƣơng pháp phát hiện một số chủng HPV nguy cơ cao
3.3.1 Xác định độ chính xác của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52 HPV16, 18 và 33/52
Tiến hành kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe với 6 mẫu dương tính (2 mẫu dương tính với HPV16, 3 mẫu dương tính với HPV18, 3 mẫu dương tính với HPV33/52) và 3 mẫu âm tính với các chủng HPV16, HPV18, HPV33 và 52 của bộ mẫu chuẩn. Xác định mức độ thống nhất của kết quả phản ứng so với giá trị thực của nó. Kết quả thu được trình bày trong Bảng 3.7 và Hình 3.15
Bảng 3.7.Kết quả thí nghiệm xác định độ chính xác của phương pháp
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 IC 1 A305 HPV16 Dương tính/24,9 Âm tính Âm tính Dương tính /26,8 2 TEB094 HPV16, 18 Dương tính /34,1 Dương tính /25,5 Âm tính Dương tính /23,2 3 A147 HPV18 Âm tính Dương tính
/32,0 Âm tính Dương tính /23,1 4 B252 HPV18,52 Âm tính Dương tính /36,4 Dương tính /23,4 Dương tính /24,5 5 A424 HPV52, 33 Âm tính Âm tính Dương tính
/18,7
Dương tính /24,4 6 B206 HPV33 Âm tính Âm tính Dương tính
/21,8
Dương tính /25,9 7 A1(*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính
/23,4 8 A2(*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính
/24,8 9 A3(*) - Âm tính Âm tính Âm tính Dương tính
/28,8 10 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
(*)
Mẫu âm tính với các chủng HPV16, 18, 33, 52
Trong 6 mẫu dương tính của bộ mẫu chuẩn có 2 mẫu cho kết quả dương tính với HPV16, tương ứng với 2 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang điển hình cắt đường threshold ở kênh HEX(Hình 3.15A); 3 mẫu cho kết quả dương tính với HPV18, tương ứng với 3 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang điển hình ở kênh Cy5(Hình 3.15B); 3 mẫu dương tính với HPV 33/52 tương ứng với 3 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang điển hình ở kênh FAM(Hình 3.15C).Kết quả trên 6 mẫu dương tính cũng tương tự như kết quả mà bộ mẫu chuẩn được xác định trước đây.
Cy5, FAM, chứng tỏ mẫu này âm tính với các chủng HPV16, 18, 33 và 52, kết quả xác định bằng phản ứng multiplexRealtime PCRcũng giống với kết quả của bộ mẫu chuẩn được xác định trước đó. Chứng âm cho kết quả âm tính trên tất cả các kênh đọc chứng tỏ khơng xảy ra sự nhiễm chéo trong q trình thao tác thí nghiệm;kênh Cy5.5 cho kết quả dương tính với cả 6 mẫu âm tính và 3 mẫu dương tính của bộ mẫu chuẩn chứng tỏ trong q trình thí nghiệm mẫu ADN được bổ sung đầy đủ vào từng phản ứng. Chứng âm và cặp primer IC đóng vai trị kiểm soát chất lượng của phản ứng, giúp kết quả của phản ứng có độ tin cậy hơn khi đánh giá độ chính xác cũng như các chỉ tiêu cịn lại.
Từ kết quả trên rút ra kết luận: phản ứng multiplex Realtime PCR cho kết quả thống nhất với kết quả của bộ mẫu chuẩn được xác định trước đó.
Hình 3.15A.HEX Hình 3.15B.Cy5
Hình 3.15C.FAM Hình 3.15D.Cy5.5
A305; A147; TEB094; B252; B557; A424; B206
Hình 3.15.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định độ chính xác
(Hình 3.15A, B, C, D tương ứng với kênh HEX, Cy5, FAMvà Cy5.5)
Chú thích:
Màu tương ứng với mẫu A305 và TEB094 thuộc genotype HPV16 Màu tương ứng với mẫu A147, TEB094, B252 thuộc genotype HPV18 Màu tương ứng với mẫu B252, B557, A422, B206 thuộc genotype HPV52
3.3.2 Xác định độ chụm (hệ số lặp lại và hệ số tái lập) của kỹ thuật realtime PCR phát hiện các chủng HPV16, 18 và 33/52
3.3.2.1 Xác định hệ số lặp lại của phƣơng pháp
Tiến hành kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe với 2 mẫu dương tính với một trong các chủng HPV16, HPV18, HPV33/52, mẫu thuộc bộ mẫu chuẩn
của nghiên cứu trong đó có 1 mẫu dương tính với HPV16 (TEB101) và 1 mẫu dương tính HPV18, 52 (B252), mỗi mẫu được lặp lại 3 lần trong 1 thí nghiệm. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.8 và Hình 3.16.Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của giá trị Ct trong 3 lần lặp lại thí nghiệm của từng mẫu được thể hiện ở Bảng 3.9 và Hình 3.17.
Bảng 3.8.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số lặp lại của phương pháp
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả /giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 Green HPV33/52 Cy5.5 IC 1 TEB101 (1) HPV16 Dương tính
/20,2 Âm tính Âm tính Dương tính /20,9 2 B252 (1) HPV18,52 Âm tính Dương tính /36,4 Dương tính /23,4 Dương tính /24,5 3 TEB101 (2) HPV16 Dương tính
/21,9 Âm tính Âm tính Dương tính /21,6 4 B252 (2) HPV18,52 Âm tính Dương tính /32,8 Dương tính /23,0 Dương tính /24,1 5 TEB101 (3) HPV16 Dương tính
/22,2 Âm tính Âm tính Dương tính /21,5 6 B252 (3) HPV18,52 Âm tính Dương tính /33,1 Dương tính/23,4 Dương tính /24,6 7 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
(1), (2), (3)
Lầnlặp lại thứ 1, 2 ,3 trong 1 thử nghiệm
Hình 3.16A.HEX Hình 3.16B.Cy5
Hình 3.16C.FAM Hình 3.16D.Cy5.5
TEB101(1); TEB101(2) ; TEB101(3) B252(1); B252(2); B252(3)
Hình 3.16.Đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số lặp lại
(Hình 3.16A, B, C, D tương ứng với kênh HEX, Cy5, FAMvà Cy5.5) Chú thích:
Màu xanh lá nhạt, xanh lá đậm, xanh dương tương ứng với lần thực hiện thứ 1, 2, 3 với mẫu B252 (HPV18, 52)
Bảng 3.9.Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại
Tên mẫu/ kênh đọc Mean 1SD 2SD
TEB101(HPV16)/HEX 21,4 1,1 2,2
B252(HPV18)/Cy5 34,1 2 4
B252(HPV52)/FAM 23,3 0,2 0,4
Mean - Giá trị trung bình; SD – Độ lệch chuẩn
Hình 3.17A
Hình 3.17B
Hình 3.17C
Mean - Giá trị trung bình; SD – Độ lệch chuẩn
Hình 3.17 Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số lặp lại
(Hình 3.17 A, B, C tương ứng với các kênh HEX, Cy5 vàFAM)
Trong cả 3 lần lặp lại trong 1 thí nghiệm, mẫu dương tính với HPV16 đều cho kết quả dương tính với kênh HEX (Bảng 3.8), với giá trị Ct không chênh lệch
sau từng chu kì sát nhau và gần như là chồng khít lên nhau. Mẫu dương tính với HPV18 kết quả dương tính với kênh Cy5, giá trị Ct có sự chênh lệch nhau, thể hiện trên Hình 3.16B có một đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang lệch xa 2 đường cịn lại. Mẫu dương tính với HPV52 đều cho kết quả dương tính trên kênh FAM, với giá trị Ct khơng chênh lệch nhau nhiều, thể hiện trên Hình 3.16C cả 3 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang sau từng chu kì sát nhau và gần như là chồng khít lên nhau. Giá trị Ct giữa 3 lần thực hiện của cùng một mẫu trên các kênh đọc tương ứng HEX, Cy5, FAM đều nằm trong khoảng Mean±2SD (thể hiện trong Bảng 3.9 và Hình 3.17A, B, C), sự biến động Ct giữa các lần thực hiện của cùng một kỹ thuật viên với phương pháp này nằm trong khoảng cho phép. Trên kênh Cy5.5, giá trị Ct thống nhất giữa cả 3 lần chạy, đường tín hiệu huỳnh quang cả 3 lần chạy của 1 mẫu đều chồng khít lên nhau.
3.3.2.2 Xác định hệ số tái lập của phƣơng pháp
Tiến hành kỹ thuật realtime PCR đa cặp primer và probe với 2 mẫu dương tính với một trong các chủng HPV16, HPV18, HPV33/52, mẫu thuộc bộ mẫu chuẩn của nghiên cứu trong đó có 1 mẫu dương tính với HPV16 (A410) và 1 mẫu dương tính HPV18, 52 (B252), mỗi mẫu được thực hiện 3 lần bởi 3 kỹ thuật viên khác nhau trong 3 lần thí nghiệm riêng biệt. Kết quả được trình bày trong Bảng 3.10 và Hình 3.18, 3.19,3.20.Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của giá trị Ct trong 3 lần thí nghiệm riêng biệt của từng mẫu được thể hiện ở Bảng 3.11 và Hình 3.21.
Kết quả tổng kết trong Bảng 3.10 cho thấy trong cả 3 lần thí nghiệm riêng biệt mẫu A410 (HPV16) đều cho kết quả dương tính trên kênh HEX tương ứng với 1 đường biểu diễn tín hiệu huỳnh quang điển hình trongHình 3.18A, 3.19A, 3.20A. Mẫu B252 (HPV18, 52) cho kết quả dương tính trên cả 2 kênh Cy5 (Hình 3.18B, 3.19B, 3.20B) và FAM (Hình 3.18C, 3.19C, 3.20C).Xác định giá trị trung bình và độ lệch chuẩn (Bảng 3.11), Ct của cùng một mẫu thực hiện bởi 3 kỹ thuật viên khác nhau đều nằm trong khoảng mean ±2SD (Hình 3.21A, B, C), sự biến động Ct giữa các kỹ thuật viên khác nhau với phương pháp này nằm trong khoảng cho phép.Tất cả các mẫu trong cả 3 lần thí nghiệm đều cho kết quả dương tính trên kênh Cy5.5, chứng âm trong 3 lần thí nghiệm đều cho kết quả âm tính, chứng tỏ khơng xảy ra sai sót nhiễm chéo và khơng có lẫn chất ức chế trong mẫu .
Bảng 3.10.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập của phương pháp Bảng 3.10A.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập thực hiện bởi kỹ thuật viên 1 Bảng 3.10A.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập thực hiện bởi kỹ thuật viên 1
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 IC 1 A410 HPV16 Dương tính
/27,2 Âm tính Âm tính Dương tính /26,9 2 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính /36,4 Dương tính /23,4 Dương tính /24,5 3 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Bảng 3.10B. Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập thực hiện bởi kỹ thuật viên 2
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 IC 1 A410 HPV16 Dương tính
/29,9 Âm tính Âm tính Dương tính /28,1 2 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính /34,0 Dương tính /23,9 Dương tính /25,8 3 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Bảng 3.10C.Kết quả thí nghiệm xác định hệ số tái lập thực hiện bởi kỹ thuật viên 3
STT Tên mẫu Genotype
Kết quả/giá trị Ct HEX HPV16 Cy5 HPV18 FAM HPV33/52 Cy5.5 IC 1 A410 HPV16 Dương tính
/29.7 Âm tính Âm tính Dương tính /28.4 2 B252 HPV18, 52 Âm tính Dương tính /34.0 Dương tính /24.0 Dương tính /25.7 3 Chứng âm - Âm tính Âm tính Âm tính Âm tính
Hình 3.18A. HEX Hình 3.18B. Cy5
Hình 3.18C. FAM Hình 3.18D.Cy5.5 A410 (HPV16); B252 (HPV18, 52)
Hình 3.18.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật
viên 1(Hình 3.18A, B, C, D tương ứng vớikênh HEX, Cy5, FAMvà Crimson)
Hình 3.19A.HEX Hình 3.19B.Cy5
Hình 3.19C.FAM Hình 3.19D.Cy5.5
A410 (HPV16); B252 (HPV18, 52)
Hình 3.19.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật
viên 2 (Hình 3.19A, B, C, D tương ứng với kênh HEX, Cy5, FAM vàCy5.5)
Hình 3.20A.HEX Hình 3.20B.Cy5
Hình 3.20C.FAM Hình 3.20D.Cy5.5
A410 (HPV16); B252(HPV18, 52)
Hình 3.20.Đường tín hiệu huỳnh quang của thí nghiệm xác định hệ số tái lập của kỹ thuật
Bảng 3.11. Giá trị trung bình và độ lệch chuẩn của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập
Tên mẫu/ kênh đọc Mean 1SD 2SD
A410(HPV16)/HEX 28,9 1,5 3
B252(HPV18)/Cy5 34,8 1,4 2,8 B252(HPV52)/FAM 23,8 0,3 0,6
Mean - Giá trị trung bình; SD – Độ lệch chuẩn
Hình 3.21A
Hình 3.21B
Hình 3.21C
Hình 3.21 Biến động giá trị Ct của thí nghiệm đánh giá hệ số tái lập
(Hình 3.21 A, B, C tương ứng vớikênh HEX, Cy5 vàFAM)
Từ kết quả trên chúng tôi đưa ra kết luận: kỹ thuậtRealtime PCR xác định các chủng HPV16, 18 và 33/52 cho kết quả thống nhất giữa các lần thí nghiệm khác nhau do cùng 1 kỹ thuật viên thực hiện và do 3 kỹ thuật viên khác nhau .