2.2 Phương pháp
2.2.1 Phương pháp cấy chuyển tế bào Vero từ điều kiện bảo quản và nhân
lượng tế bào Vero trên chai nuơi một lớp
Nguyên tắc
Tế bào Vero được cất giữ trong mơi trường cĩ huyết thanh và chất bảo quản DMSO, chất bảo quản này giúp cho tế bào khơng bị chết khi cất giữ ở nhiệt âm sâu (nitơ lỏng -196 °C), nhưng đồng thời cũng là chất cĩ thể gây độc tế bào khi chuyển lại điều kiện nuơi cấy bình thường. Các ống tế bào sẽ được đơng tan nhanh trong nước ấm (37oC) và chuyển vào trong mơi trường nuơi cấy, mơi trường với DMSO tồn dư được loại bỏ sau 1 ngày. Tế bào sau khi nhân lên phủ kín bề mặt chai sẽ được tách chuyển tiếp sang các chai nuơi mới.
Các bước tiến hành
- Hút chuyển 24 ml mơi trường MEM 10%FBS vào chai nuơi tế bào 75cm2, làm ấm mơi trường bằng bể ổn nhiệt tại 37oC, 10 phút.
- Lấy ống tế bào Vero bảo quản trong N2 lỏng, cho nhanh vào cốc nước 37oC. - Khi hỗn dịch trong ống tế bào tan hồn tồn, hút tồn bộ hỗn dịch, từ từ
chuyển vào trong chai nuơi tế bào cĩ mơi trường đã được làm ấm. (Thực hiện trong tủ an tồn sinh học)
- Lắc nhẹ chai cho tế bào lan đều bề mặt, chuyển vào tủ ấm 37oC.
- Sau 24h, kiểm tra mức độ bám của tế bào Vero trên bề mặt chai, hút bỏ tồn bộ mơi trường cũ (cĩ chứa DMSO), chuyển 25ml mơi trường MEM 10%FBS đã làm ấm vào các chai.
- Tiếp tục nuơi và theo tế bào tại 37oC từ 3-5 ngày.
b. Cấy chuyển, nhân thêm tế bào trên chai nuơi cấy một lớp
- Kiểm tra chai tế bào (nuơi từ 2-3 ngày) trước khi tiến hành: mơi trường nuơi cấy trong suốt, màu đỏ cam, tế bào phủ kín 90-100% bề mặt. (Hình 9)
- Ủ ấm mơi trường MEM 10%FBS, Trypsin và PBS trong 37oC từ 15 đến 30 phút.
- Chuyển các chai tế bào, dụng cụ và hĩa chất vào trong tủ an tồn sinh học. - Hút sạch tồn bộ nước nổi trong các chai tế bào.
- Chuyển 10 ml PBS vào trong chai tế bào (75 cm2). Tráng rửa bề mặt rồi hút bỏ tồn bộ PBS.
- Lặp lại bước trên thêm 1 lần.
- Chuyển 1 ml dung dịch Trypsin 0.25% vào trong chai tế bào (75 cm2), láng đều bề mặt.
- Ủ các chai trong 37oC từ 3-5 phút, soi kính hiển vi kiểm tra tế bào tách khỏi bề mặt chai.
- Vỗ nhẹ vào thành chai cho tế bào tách hồn tồn.
- Chuyển 9 ml mơi trường MEM 10%FBS vào chai tế bào để trung hịa trypsin.
- Lấy mẫu hỗn dịch tế bào để đếm bằng buồng đếm tế bào. Tính mật độ tế bào trong hỗn dịch tế bào thu được.
- Chuyển tế bào trong hỗn dịch thu được vào mỗi chai nuơi cấy mới (75 cm2) từ 106 đến 2,5x106 tế bào.
- Thêm mơi trường MEM 10%FBS vừa đủ đến 25 ml vào mỗi chai.
- Chuyển các chai nuơi cấy tế bào mới vào tủ ấm 37oC, theo dõi từ 2-3 ngày.
Hình 9. Tế bào Vero sau khi nuơi cấy.
A: Sau 1 ngày, B: sau 2 ngày, C: Sau 3 ngày.