CHƯƠNG 3 : KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN
3.2 Sản xuất các chủng virút gốc giống
Tồn bộ quá trình sản xuất chủng gốc giống cho vắcxin dengue được tiến hành trong khu vực sạch (class 10000) và trong các tủ sinh học (class 100) đảm bảo vơ trùng, được kiểm tra và kiểm sốt thường xuyên bởi phịng quản lý chất lượng.
3.2.1 Gây nhiễm chủng virút dengue trên tế bào Vero
Ứng dụng quy trình cơng nghệ đã xây dựng được (hình 11) nhĩm nghiên cứu đã tiến hành sản xuất các chủng gốc giống như sau:
- Nuơi cấy tế bào Vero:
+ Tế bào Vero đời P139 được cấy chuyển ra chai cĩ chứa mơi trường MEM 10% FBS, từ điều kiện bảo quản Nitơ lỏng. Sau 3-4 ngày, tế bào trong chai được nhân tách chuyển sang các chai mới.
+ 04 chai tế bào T150 đời P142 phủ kín sẽ được dùng để gây nhiễm với mỗi chủng dengue.
- Gây nhiễm dengue:
+ Kiểm tra các chai tế bào Vero trước khi gây nhiễm, tế bào phủ kín 90 – 95% bề mặt.
+ Tách đếm đại diện số lượng tế bào cĩ trong các chai cần gây nhiễm.
+ Pha lỗng lượng virút dengue cần cho liều gây nhiễm MOI=0.01 trong mơi trường nuơi tương ứng.
+ Các chai tế bào được được gây nhiễm với các chủng rDEN trong 30 phút tại 37oC.
- Bổ sung mơi trường nuơi cấy LH3E (45 ml/chai) cho các chủng rDEN1∆30, rDEN2/4∆30(ME) , rDEN4∆30, rDEN4∆30-200. Bổ sung mơi trường MEM OPTI PRO SFM (45 ml/chai) cho các chủng rDEN3∆30/31 và rDEN3- 3’D4∆30 được nuơi trong mơi trường MEM OptiPro SFM, mỗi chai T150 được bổ sung 45 ml mơi trường.
- Ủ các chai tế bào sau gây nhiễm ở các nhiệt độ 35oC đối với các chủng rDEN2/4∆30(ME) và rDEN4∆30-200,201 hoặc 37oC đối với các chủng
3.2.2 Thu hoạch chủng virút dengue trên tế bào Vero
Sau 6 hoặc 7 ngày nuơi cấy các chủng được tiến hành thu hoạch. Bổ sung 5ml SPG 10X vào mỗi chai nuơi cấy virút. Ly tâm và lọc hỗn dịch bằng màng 0.22 µm. Tổng thể tích mỗi chủng gốc giống thu được 300 ml.
Hỗn dịch virút sau lọc được chuyển vào 100 ống tuýp (cryovial) 2 ml cĩ dán nhãn chủng gốc giống tương ứng, mỗi ống 1 ml. Bảo quản các ống chủng thu được trong tủ -80oC.
Phần hỗn dịch virút cịn lại được cất giữ trong các falcon để làm các kiểm tra đánh giá.
Như vậy, nhĩm nghiên cứu đã sản xuất được 600 ống chủng virút gốc giống (100 ống cho mỗi chủng).