2.2 Phương pháp
2.2.5 Phương pháp nhuộm miễn dịch đám hoại tử
Nguyên tắc
Do virút dengue cĩ tính hủy hoại yếu nên phương pháp nhuộm plaque thơng thường như crystal violet khơng phát hiện được mà phải sử dụng bằng phương pháp nhuộm miễn dịch. Đầu tiên kháng thể được đưa vào các giếng và gắn vào virút, tiếp theo kháng thể 2 cộng hợp peroxidase được đưa vào để gắn với kháng thể 1. Cuối cùng cơ chất được đưa vào để hiện màu (Hình 12)
Các bước tiến hành
a. Cố định tế bào
- Hút bỏ tồn bộ mơi trường trong mỗi giếng trên phiến sau 5 - 6 ngày nuơi ủ. Tráng rửa mỗi giếng 1 ml PBS + 10 % formandehit, 2 lần.
- Thêm 0.5 ml methanol 80 % vào mỗi giếng, ủ nhiệt độ phịng trong 10 phút. b. Nhuộm phiến
- Bỏ tồn bộ methanol dư thừa.
- Thêm 1 ml dung dịch PBS + 5% skim milk vào mỗi giếng. Ủ tại nhiệt độ phịng 10 phút.
- Đổ bỏ dung dịch trong phiến vào cốc đựng.
- Thêm vào mỗi giếng 200 µl dung dịch đã pha lỗng kháng thể kháng týp huyết thanh dengue tương ứng. Ủ phiến trong máy lắc ở nhiệt độ 37oC, lắc 60 vịng/ phút, trong 60 phút.
- Đổ bỏ dung dịch kháng thể vào cốc đựng.
- Rửa mỗi giếng 2 lần bằng 1 ml dung dịch PBS + 5 % Skim milk.
- Thêm vào mỗi giếng 200 µl dung dịch kháng thể IgG dê kháng chuột cộng hợp peroxidase (pha lỗng 1:2000 trong dung dịch PBS + 5 % Skim milk). Ủ phiến trong máy lắc ở nhiệt độ 37oC, 60 vịng/ phút, trong 60 phút.
- Đổ bỏ dung dịch kháng thể vào cốc đựng.
- Rửa mỗi giếng 2 lần bằng 1 ml dung dịch PBS, loạt bỏ hết dung dịch rửa. - Đặt phiến tại nơi thống giĩ, để phiến khơ tự nhiên trong khoảng 5 phút.
- Thêm vào mỗi giếng 160 µl dung dịch TrueBlue substrate. Lắc nhẹ phiến và giữ tại nhiệt độ phịng tới khi các plaque hiện màu (khoảng 5 – 15 phút). Đếm số lượng plaques trong các giếng. Ghi số lượng plague vào phiếu đọc kết quả.