Phƣơng pháp phân loại chủng vi sinh vật

2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu

2.3.4. Phƣơng pháp phân loại chủng vi sinh vật

 Nhuộm Gram

Dựa vào sự khác biệt giữa thành tế bào vi khuẩn Gram (+) và Gram (-). Vi khuẩn Gram (+) có peptidoglican hoạt động nhƣ một hàng rào thẩm thấu ngăn cản sự thất thoát của tinh thể tím [2].

Kết quả khi nhuộm gram vi khuẩn Gram (+) bắt màu xanh tím, vi khuẩn Gram (-) bắt màu đỏ hồng.

 Chụp ảnh hiển vi điện tử quét

- Chuẩn bị mẫu vi khuẩn: Các mẫu vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên đĩa thạch LB không quá 24 giờ ở 37C.

- Gắn mẫu vi khuẩn lên lamen, hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn để cố định mẫu. - Soi và chụp ảnh trên kính hiển vi điện tử quét JSM-5421LV (Nhật Bản) tại phòng Chụp hiển vi điện tử quét - Trung Tâm Khoa Học Vật Liệu - Khoa Vật lý - Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên

 Giải trình tự gen 16S rRNA

Để xác định sau hơn về cây phát sinh chủng loại chủng H11 chúng tơi đã tiến hành giải trình tự gen mã hóa 16S ARNr của chủng H11. Phƣơng pháp tách chiết, khuếch đại và xác định trình tự ADNr 16S theo quy trình của Sakiyama và cộng sự [43]. Trình tự ADNr 16S đƣợc phân tích trên phần mềm CLUSTAL X của Thompson và cộng sự [46]. Trình tự tham khảo đƣợc lấy từ dữ liệu của DDBJ, EMBL và ngân hàng gen. Cây phát sinh chủng loại đƣợc xây dựng theo Kimura sử dụng phƣơng pháp của Saitou và Nei [30,42].

Các mẫu vi khuẩn đƣợc nuôi trên môi trƣờng thạch LB trong vịng 24 giờ sau đó đƣợc giải trình tự bởi Viện Vi Sinh Vật và Cơng Nghệ Sinh Học, ĐHQG Hà Nội.

Phản ứng khuếch đại ADN:

Thành phần phản ứng (l): 10X buffer-10; dNTP 2 mM-10; mồi xuôi 9F (10 pmol/l)-4; mồi ngƣợc (10 pmol/l)-4; Taq polymerase (5u/l)-1; ADN khn (50- 100g/l)-1-2; H2O đủ 100l

Chu trình nhiệt: 95oC - 3 phút, 35 chu kỳ; 95oC – 30 giây; 55oC - 30 giây ; 72oC - 1 phút 30 giây; 4oC - .

- Mồi cho khuếch đại ADNr 16S

Mồi xuôi 9F: 5′-GAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′ Mồi ngƣợc 1492R: 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ - Mồi cho đọc trình tự : sử dụng 2 mồi 1492R và 800R

800R : 5’-CAGGACTACCAGGGTATCTAAT-3’