2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.7. Đánh giá khả năng phân hủy hợp chất 2,2DCPS
Khả năng phân hủy hợp chất 2,2 DCPS của chủng vi sinh vật đƣợc đánh giá bằng phƣơng pháp xác định gián tiếp thông qua lƣợng sản phẩm Cl- tạo ra trong dịch ngoại bào của vi khuẩn. Khi vi sinh vật sử dụng cơ chất sinh trƣởng phát triển thì dehalogenase của vi sinh vật sẽ cắt đứt liên kết C-Cl giải phóng clo dƣới dạng
Cl-. Ion Cl- trong dung dịch có thể xác định đƣợc bằng phƣơng pháp thủy ngân thiocyanate [14, 17].
Phương pháp xác định hàm lượng ion Cl- dựa trên thủy ngân thyocianate:
Xác định hàm lƣợng Cl- ngoại bào đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Bergmann và Sanik [14]. Cl- tạo ra cho phản ứng với thủy ngân thyocianate Hg(SCN)2 (0,69g/l) và NH4Fe(SO4)2 0,25M tạo thành sản phẩm có màu đỏ cam có thể định lƣợng ở bƣớc sóng 460nm [21].
Phương trình phản ứng:
Hg(SCN)2 + 2Cl- HgCl2 + 2SCN- Fe3+ + 3SCN- Fe(SCN)3 (màu đỏ cam)
Quy trình thí nghiệm như sau:
Bƣớc 1. Xây dựng đƣờng chuẩn Cl-
Hóa chất cần chuẩn bị
- Hg(SCN)2 (0,69g/l) pha trong ethanol tuyệt đối. - NH4Fe(SO4)2 0,25M pha trong HNO3 9N.
- Muối NaCl tinh khiết.
Các bước tiến hành
- Cân 0,0585g NaCl hòa tan trong 100ml đệm Tris-acetate pH 7,5 cho dung dịch NaCl 10mM.
- Pha loãng từ dung dịch NaCl 10mM trong đệm để đƣợc các nồng độ khác nhau. - Lấy 1ml từ các nồng độ đã pha loãng cho vào các ống nghiệm thủy tinh. - Bổ sung 100µl Hg(SCN)2 và 100µl NH4Fe(SO4)2 0,25M trộn đều hỗn hợp để trong vòng 10 phút tại nhiệt độ phịng sau đó tiến hành đo OD460nm.
- Dùng phần mềm excel xây dựng đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc giữa giá trị OD460nm và hàm lƣợng Cl- trong mẫu.
đƣờng chuẩn Cl- (hình 4)
Hình 4. Đƣờng chuẩn nồng độ NaCl với ion Cl- có trong mẫu Bƣớc 2. Đánh giá khả năng phân hủy cơ chất: Bƣớc 2. Đánh giá khả năng phân hủy cơ chất:
- Tiến hành nuôi lắc các chủng vi sinh vật trênmôi trƣờng MGB lỏng theo ngày.
- Thu dịch nuôi cấy ly tâm 10.000v/p trong 10 phút ở 4oC.
- Dịch ngoại bào cho phản ứng với phức sắt và thủy ngân thiocyanate tƣơng tự trong đƣờng chuẩn.
Đo OD460nm thu đƣợc kết quả khả năng phân hủy cơ chất 2,2 DCPS.