Bƣớc 2. Đánh giá khả năng phân hủy cơ chất:
- Tiến hành nuôi lắc các chủng vi sinh vật trênmôi trƣờng MGB lỏng theo ngày.
- Thu dịch nuôi cấy ly tâm 10.000v/p trong 10 phút ở 4oC.
- Dịch ngoại bào cho phản ứng với phức sắt và thủy ngân thiocyanate tƣơng tự trong đƣờng chuẩn.
Đo OD460nm thu đƣợc kết quả khả năng phân hủy cơ chất 2,2 DCPS.
2.3.8. Phƣơng pháp nghiên cứu tinh sạch dehalogenase
Chuẩn bị dịch chiết thô enzym dehalogenase
Dịch chiết đƣợc chuẩn bị từ tế bào vi khuẩn đang phát triển ở giai đoạn cuối của pha log. Vi khuẩn đƣợc ni trong mơi trƣờng MGB có chứa 25mM cơ chất 2,2 DCPS. Sau đó 500ml dịch tế bào vi khuẩn đƣợc ly tâm ở 10.000g 10 phút ở 4oC. Cặn tế bào thu đƣợc đem rửa trong 100ml dung dịch đệm Tris-acetate 0,1M, pH 7,6, và tiếp tục ly tâm lần thứ 2 trong điều kiện nhƣ trên. Tế bào vi khuẩn thu đƣợc hòa tan trong 15ml Tris-acetate 0,1M, pH 7,6, để tiến hành siêu âm phá tế bào. Siêu âm phá tế bào đƣợc thực hiện theo từng bƣớc phá tế bào 15s, nghỉ 30s và đƣợc lặp lại 5 lần với cƣờng độ λ = 10 µm. Sau đó các mảnh vỡ tế bào đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm ở điều kiện 20.000g, trong 15 phút, ở 4oC [17, 24].
Dựng đường chuẩn protein
Chuẩn bị thuốc thử Bradford: (200ml)
- 20mg Coomasie Brilliant Blue R250 - 10ml cồn 90o
- 20ml H3PO4 85% - 150ml H2O
Pha lỗng Albumin huyết thanh bị (BSA) có nồng độ 1mg/1ml.
Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị 7 ống nghiệm, bổ sung vào các ống lần lƣợt 1; 2,5; 5; 10; 15; 25µl BSA. Bổ sung nƣớc cất khử trùng vào các ống nghiệm trên cho thể tích cuối cùng đạt 200µl. Một ống nghiệm khơng chứa BSA đƣợc sử dụng làm mẫu blank. Sau đó bổ sung vào mỗi ống 2ml thuốc thử Bradford sau 2 phút đo OD 595nm. Dùng phần mềm excel xây dựng đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc giữa giá trị OD 595nm và hàm lƣợng protein trong mẫu.