M: marker protein; dịch thô: hai phân đoạn 8 và 10 sau khi qua cột sắc ký qua gel Q sepharose; các giếng 1-5: là các phân đoạn thu đƣợc sau khi lọc gel.
Sau khi qua cột sắc ký lọc gel enzym dehalogen đã đƣợc tinh sạch hơn ở 2 làn thứ 1 và 2 (tƣơng ứng với phân đoạn thứ 6 và 8 sau khi qua sắc ký lọc gel). Các băng chứa protein không quan tâm đã giảm đi rất nhiều, điều này chứng tỏ enzym dehalogen có kích thƣớc 36kDa gần nhƣ đã đƣợc tinh sạch ở phân đoạn thứ 6 và 8 sau khi lọc gel.
Các phân đoạn có chứa protein đƣợc thu thập trong khoảng 20 phân đoạn đầu tiên sau khi chạy qua cột sắc ký trao đổi anion Q sepharose. Các phân đoạn này sẽ đƣợc kiểm tra hoạt tính để xác định xem có sự tồn tại của enzym dehalogen hay khơng. Trong đó có 2 phân đoạn thứ 8 và 10 có hoạt tính enzym mạnh nhất. Sau đó tiến hành phân tích SDS-PAGE để kiểm tra độ tinh sạch của enzym thu đƣợc. Đồng thời chúng tơi phân tích trên một bản gel khơng biến tính phân đoạn chứa enzym để xác định chính xác kích thƣớc của enzym. Sau đó chúng tơi phải tiến hành chạy thông qua cột thứ hai bằng gel Sephadex G-75 để tinh sạch protein có kích thƣớc 36kDa.
Ngồi protein kích thƣớc 36kDa mà chúng tơi quan tâm cịn có sự xuất hiện của một protein có kích thƣớc khoảng 31kDa cũng có khả năng hình thành enzym dehalogenase đã đƣợc Fahrul huyop và Ronald cooper phân lập [22].
Enzym có khả năng phân hủy 2,2 DCPS từ chủng H11 có kích thƣớc khoảng 36kDa đã đƣợc tinh sạch bƣớc đầu. Các nghiên cứu cần tiếp tục để tinh sạch và nghiên cứu cụ thể hơn về enzym này là rất cần thiết, cũng nhƣ tìm hiểu về tính chất của enzym phân lập.
KẾT LUẬN
1. Phân lập đƣợc 20 chủng vi sinh vật trên mơi trƣờng có bổ sung 2,2 DCPS là nguồn cacbon, các khuẩn lạc chủ yếu có hình trịn, kích thƣớc khoảng từ 0,5-5mm. Đa số có màu trắng trong hoặc trắng đục, một số có màu vàng nhạt hoặc vàng chanh. Trong đó chủng vi khuẩn H11 có hoạt tính mạnh nhất và là vi khuẩn gram âm. Quan sát ảnh chụp hiển vi điện tử quét, chủng H11 có dạng que ngắn, bề mặt xù xì đƣờng kính sợi tế bào là khoảng 1,5µm, chiều dài tế bào là khoảng 3µm
2. Dựa vào hình thái khuẩn lạc, tế bào và kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng H11 tƣơng đồng 99,23 % (1419/1430 bp) với trình tự gen rARN 16S của Alcaligenes faecalis_D88008. Điều kiện sinh trƣởng tối ƣu của chủng H11 trong khoảng nhiệt độ 25-37oC, nồng độ cơ chất là 25mM. Alcaligenes faecalis_H11 có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau các loại đƣờng đơn
nhƣ Glucose, Arabinose,...
3. Sau 24 giờ tiến hành nuôi cấy chủng Alcaligenes faecalis_H11 trên
môi trƣờng MGB chứa 25mM 2,2 DCPS. Hàm lƣợng Cl-
đƣợc tạo ra trong môi trƣờng ni cấy là 70µM sau 24h, tƣơng đƣơng với 0,28% DCP bị phân hủy
4. Bƣớc đầu tinh sạch enzym dehalogenase từ chủng H11 có kích thƣớc 36kDa, và là một dimer protein.
KIẾN NGHỊ
Mục đích của nghiên cứu này là tinh sạch và nghiên cứu tính chất enzym dehalogenase từ chủng vi sinh vật phân lập tại Việt Nam. Ngoài những kết quả đã đạt đƣợc thì các nghiên cứu tiếp theo sâu hơn về đề tài này là rất cần thiết nhƣ:
1. Tối ƣu điều kiện sinh trƣởng của H11 trên cơ chất 2,2 DCPS trong thời gian dài hơn. Đánh giá sự ảnh hƣởng của một số yếu tố kim loại nặng lên sự sinh trƣởng của H11.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt:
1. Đào Hùng Cƣờng, Nguyễn Minh Thiên, Nguyễn Trần Nguyên (2008), ―Nghiên cứu xác định một số hợp chất clo trong nƣớc mặt, trong đất thuộc địa bàn thành phố Đà Nẵng‖, Tạp chị Khoa học và Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 6(29), tr. 57-58. A9
2. Kiều Hữu Ảnh (2006), Giáo trình vi sinh vật học phần 1, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 81-82. (36)
3. Lê Bảo Hƣng (2012), ―Nghiên cứu điều kiện phân tích các hợp chất hữu cơ clo PCB trong mẫu môi trƣờng bằng phƣơng pháp GC-MS‖, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 39
4. Ngơ Thị Kim Tốn (2012), Nghiên cứu phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh
vật ứng dụng xử lý nước thải giàu nitơ, photpho, luận văn thạc sỹ sinh học
thực nghiệm, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 46-47. (56)
5. Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007), ―Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử loại clo Dehalococcoides trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCR-DGGE‖, Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển nông thôn, 16, tr.
41-45.
6. Nguyễn Thị Kim Cúc; Phạm Việt Cƣờng; Nguyễn Thị Tuyết Mai (2000), ―Một số tính chất của vi khuẩn phân huỷ methyl parathion phân lập từ các mẫu đất tại Hà Nội‖, Hội nghị sinh học quốc gia: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học, Hà Nội, 29-34
7. Nguyễn Tuấn Khanh (2010), Đánh giá ảnh hưởng của sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật đến sức khỏe người chuyên canh chè tại Thái Nguyên và hiệu quả của các biện pháp can thiệp, luận án tiến sỹ Y học, trƣờng Đại học Thái
Nguyên. (G)
8. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, Nxb Giáo Dục Việt Nam. Tr 38-40 (40)
9. Trần Thị Vân Thi (2007), ―Đánh giá sự tồn dƣ và tích lũy của các hợp chất ơ nhiễm chứa clo khó phân hủy tại các vùng cửa sông và đầm phá Thừa Thiên
Huế, miền Trung Việt Nam‖, Báo cáo Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á, ĐHQGHN. A8
10. Trần Thúy Hằng (2011), Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) ở Việ tNam, luận
văn thạc sĩ khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. (55)
11. Hà Minh Trung (2000), Nghiên cứu ảnh hưởng của hoá chất độc hại dùng trong nông nghiệp tới sức khoẻ con người, các biện pháp khắc phục, Viện Bảo
Vệ Thực Vật, 1-3.
Tiếng Anh
12. (1987), ―Dalapon health advisory office of drinking water‖, U.S. Environmental protection agency, 1-12.
13. (2008), ―Pesticides‖, Children's Health and the Environment.
14. Bergmann JG. , John S (1957), ―Determination of trace amounts of chlorine in naphtha‖, Analytical Chemistry, 29 (2), pp 241–243.
15. Dwivedi AH and Pande UC (2011), ―Photochemical degradation of halogenated compounds: A review‖, Scientific reviewsand Chemical Communications: 2(1), 41-65.
16. Eleanor KM, Berry AN and Skinner AJ (1978), ―Degradation of the selective herbicide 2,2-Dichloropropionate (Dalapon) by a soil bacterium‖,
JournalofGeneralMicrobiology110, 39-45.
17. Fahrul ZH and Ronald C (2012), ―Degradation of millimolar concentration of the herbicide dalapon (2,2-Dichloropropionic acid) by rhizobium sp isolated
from soil‖, Biotechnol & Biotechnol, 26(4), pp. 3106-3107.
18. Fetzner S and Ligens F, 1994.―Bacterial dehalogenases: Biochemistry, genetics, and biotechnological application‖,Microbiol.Rev 58 (4):641-685 19. Gordon WG (1994), "Natural Organohalogens—Many More Than You
20. Greaves MP, Davies HA, Marsh JA, Wingfield GI (1981), ―Effects of pesticides on soil microflora using dalapon as an example‖. Arch Environ Contam Toxicol, 10(4):437-49.
21. Hamid. A, Hamdan S, Ariffin SHS, and Huyop F (2010), ―Molecular prediction of dehalogenase producing microorganism using 16S DNA analysis of 2,2-dichloropropionate degrading bacterium isolated from volcanic soil‖,
Journal of Biological Sciences, Vol. 10, pp. 190-199.
22. Hardman DJ and JH Slater (1981), ―Dehalogenases in soil bacteria‖, J. Gen. Microbiol., pp. 117-128
23. Hareland WA, Crawford RL, Chapman, PJ and Dagley S (1975). ―Metabolic function and properties of a 4-hydroxyphenyl acetic acid 1-hydroxylase from
Pseudomonasacidovorans‖. JournalofBacteriology121, 272-285.
24. Hirsch P, Alexander M (1960), ―Microbial decomposition of halogenated propionic and acetic acids‖, Can J Microbial, 6, pp. 241-249.
25. Iwaji I, Satori U, Takejiro O (1952), ―New colorimetric determination of chloride using mercuric thiocyanate and ferric ion‖, Bulletin of The Chemical Society of Japan, 25(3): pp. 226-226.
26. Janssen DB, Dinkla IJ, Poelarends GJ, and Terpstra P (2005), ―Bacterial
degradation of xenobiotic compounds: evolution and distribution of novel enzyme activities‖, Environ. Microbiol. 7:1868–1882.
27. Jensen HL, Gemmell CG (1964). ―Some studies on trichloroacetate- decomposing soil bacteria‖. ArchivfürMikrobiologie, 48:386-392.
28. Jing NH, Sulaiman FH, Wahab RA, Pakingking JR & Huyop F (2008). ―Purification and properties of a non-stereospecific dehalogenase enzyme E (DehE) from Methylobacterium sp. HJ1‖. African Journal of Microbiology Research, 2(7), 187-191.
29. John H. Montgomery(1997), Agrochemicals Desk Reference, 2nd , CRC Press, USA, pp: 126.
30. Kimura M. (1980), ―A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences‖, J Mol
31. Magee LA and Colmer AR (1959), ―Decomposition of 2,2-dichloropropionic acid by soil bacteria‖. CanadianJournalofMicrobiology, 5, pp. 255-260.
32. Marzorati M, Balloi A, Ferra F, Corallo L, Carpani G, Lieven W, Verstraete W Daffonchio D ( 2010), ―Bacterial diversity and reductive dehalogenase redundancy in a 1,2 dichloroethane degrading bacterial consortium enriched from a contaminated aquifer‖, Microbial Cell Factories 9:12.
33. McKernan LT, Ruder AM, Petersen MR, Hein MJ, Forrester CL, Sanderson WT, Ashley DL, Butler MA (2008), ―Biological exposure assessment to tetrachloroethylene for workers in the dry cleaning industry‖, Environmental Health, pp. 1186-1476.
34. Mesri S, Wahab RA, Huyop F (2009) ― Degradation of 3-Chloropropionic Acid (3CP) by Pseudomonas sp. B6P Isolated from a Rice Paddy
Field‖,Ann.Microb, 59(3): 447-451.
35. Mona KM, Parisa KM(2013 ), ―Review of Isolation of Potential Dehalogenase Marine Bacteria that can Degrade 2,2 -chloropropionate (2,2- DCP)‖, Journal of Academic and Applied Studies, Vol. 3(11), pp. 45-64
36. Motosugi K, Esaki N, Soda K (1982) ―Purification and properties of 2haloacid dehalogenase from P. Putida‖,Agric. Biol. Chem, 46:837 – 838. 37. Mowafy AM, Kurihara T, Kurata A, Uemura T, Esaki N. (2010), ―2-
haloacrulate Hydratase, a new class of flavoenzyme that catalyzes the addition of water to the substrate for dehalogenation‖,Appl. Environ. Microbiol, 76(18), pp. 6032-6037.
38. Niki Gupta (2009), Chlorine in Medicine, India.
39. Parin DS, Shailesh RD (2012), ―Enzymatic degradation of textile dye Reactive
Orange 13 by newly isolated bacterial strain Alcaligenes faecalis PMS-1‖,
International Biodeterioration & Biodegradation vol 69, 41-50.
40. Poland A, Greenlee WF, Kende AS. (1979), ―Studies on the mechanism of action of the chlorinated dibenzo-p-dioxins and related compounds‖, Ann N Y Acad Sci., 31, pp. 214–230.
41. Roslan DD, Gicana RG, Lamis RJ, Rolando VP, and Huyop F (2011), ―Isolation of bacteria from volcanic area gunung Sibayak and molecular
analysis of 2,2-Dichloropropionic acid degrading bacteria using 16S rDNA‖,
Empowering Science, Technology and Innovation TowardsaBetter Tomorrow,
pp. 740-749.
42. Saitou N. & Nei M. (1987), The neighbor-joining method: a new method for reconstructing phylogenetic trees, Mol Biol Evol 4: 406-425
43. Sakiyama Y, Nguyen, KNT, Nguyen MG, Miyadoh S, Duong VH & Ando K. (2009), ―Kineosporiababensis sp. nov., isolated from plant litter in Vietnam‖, Int J Syst Evol Microbiol 59, 550-554
44. Schwarze R, Brokamp A, Schmidt FRJ (1997), ―Isolation and characterization of dehalogenases from 2,2-Dichloropropionate degrading soil bacteria‖, Currentmicrobiology 34, 103-109.
45. Stringfellow JM, Cairns SS, Cooper RA (1997), ―Haloalkanoate dehalogenase I1 (DehE) of a Rhizobium sp. Molecular analysis of the gene and formation of carbon monoxide from trihaloacetate by the enzyme‖, Eur. J. Biochem, (250),
789-793.
46. Thompson JD, Gibson TJ, Plewniak F, Jeanmougin F & Higgins DG (1997), The CLUSTAL_X windows interface: flexible strategies for multiple sequence alignment aided by quality analysis tool, Nucleic Acids Res 25: 4876-4882.
47. Vinyl Environmental Council (2007), PVC Leads Climate Change Mitigation and Risk Reduction for Sustainable Development, Japan.
48. Wen YW and Fahrul H (2012), ―Molecular identification and characterization of Dalapon-2,2-dichloropropionate (2,2-DCP) degrading bacteria from a rubber estate agricultural area‖, AfricanJournalofMicrobiologyResearch 6(7),
1520-1526.
49. Widehem P, Aït-Aïssa S, Tixier C, Sancelme M, Veschambre H, Truffaut N. (2002), ―Isolation, characterization and diuron transformation capacities of a bacterial strain Arthrobacter sp. N2‖, Chemosphere, 46(4):527-34.
50. Wong WY and Huyop F (2011). “Characterization of a Labrys sp. strain Wy1 able to utilize 2,2-dichloropropionate (2,2-DCP) as sole source of carbon‖,
51. Yadav JS and Reddy CA (1993), ―Mineralization of 2,4- dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and mixtures of 2,4-D and 2,4,5- trichlorophenoxyacetic acid by Phanerochaetechrysosporium”, Applied and Environmental Microbiology, 59: 2904-2908. Website 52. http://baohoabinh.com.vn/28/73885/ 53. http://vietbao.vn/Khoa-hoc/ 54. http://vea.gov.vn/ 55. http://vi.swewe.net/word_show.htm/?130999_1&Alcaligenes_faecalis 56. http://www.who.int/ceh/capacity/Pesticides.pdf 57. http://www.eurochlor.org/media/70861/2013-annualreview-final.pdf 58. http://tailieuhoctap.vn/chi-tiet-sach/212-nganh-khoa-hoc-ky-thuat/khoa-hoc- moi-truong/773047-mot-so-anh-huong-cua-san-xuat-nong-nghiep-toi-moi- truong-va-sinh-vat 59. http://eia.vn/VBPL/QCVN/QCVN15.doc 60. http://mtvinaxanh.vn/Giai-phap/XL-nuoc-thai/Cac-bien-phap-xu-ly-dat-bi-o- nhiem-thuoc-bao-ve-thuc-vat/5-31c31.html 61. http://water.epa.gov/drink/contaminants/basicinformation/dalapon.cfm 62. http://www.bio-protocol.org/wenzhang.aspx?id=80 63.http://www.btk.fi/fileadmin/Page_files/proteomics/PDFfiles/Protocols/Coomassi e_Blue_staining_version_W.01.pdf 64. http//suckhoedoisong.vn/2010060404122443p0c14/thuoc-bao-ve-thuc-vat-dang- hoa-chat-loi-it-hai-nhieu.htm