2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.8. Phƣơng pháp nghiên cứu tinh sạch dehalogenase
Chuẩn bị dịch chiết thô enzym dehalogenase
Dịch chiết đƣợc chuẩn bị từ tế bào vi khuẩn đang phát triển ở giai đoạn cuối của pha log. Vi khuẩn đƣợc ni trong mơi trƣờng MGB có chứa 25mM cơ chất 2,2 DCPS. Sau đó 500ml dịch tế bào vi khuẩn đƣợc ly tâm ở 10.000g 10 phút ở 4oC. Cặn tế bào thu đƣợc đem rửa trong 100ml dung dịch đệm Tris-acetate 0,1M, pH 7,6, và tiếp tục ly tâm lần thứ 2 trong điều kiện nhƣ trên. Tế bào vi khuẩn thu đƣợc hòa tan trong 15ml Tris-acetate 0,1M, pH 7,6, để tiến hành siêu âm phá tế bào. Siêu âm phá tế bào đƣợc thực hiện theo từng bƣớc phá tế bào 15s, nghỉ 30s và đƣợc lặp lại 5 lần với cƣờng độ λ = 10 µm. Sau đó các mảnh vỡ tế bào đƣợc loại bỏ bằng cách ly tâm ở điều kiện 20.000g, trong 15 phút, ở 4oC [17, 24].
Dựng đường chuẩn protein
Chuẩn bị thuốc thử Bradford: (200ml)
- 20mg Coomasie Brilliant Blue R250 - 10ml cồn 90o
- 20ml H3PO4 85% - 150ml H2O
Pha lỗng Albumin huyết thanh bị (BSA) có nồng độ 1mg/1ml.
Tiến hành thí nghiệm:
Chuẩn bị 7 ống nghiệm, bổ sung vào các ống lần lƣợt 1; 2,5; 5; 10; 15; 25µl BSA. Bổ sung nƣớc cất khử trùng vào các ống nghiệm trên cho thể tích cuối cùng đạt 200µl. Một ống nghiệm khơng chứa BSA đƣợc sử dụng làm mẫu blank. Sau đó bổ sung vào mỗi ống 2ml thuốc thử Bradford sau 2 phút đo OD 595nm. Dùng phần mềm excel xây dựng đƣờng chuẩn thể hiện sự phụ thuộc giữa giá trị OD 595nm và hàm lƣợng protein trong mẫu.
Hình 5. Đƣờng chuẩn nồng đơ protein (BSA)
Phương pháp phân tích hoạt tính enzym dehalogen
Hoạt tính enzym đƣợc xác định bằng tổng lƣợng ion Cl- đo đƣợc trong hỗn hợp phản ứng ở điều kiện 30oC. Hỗn hợp phản ứng gồm 4,700µl Tris-acetate 0,1M, pH 7,6, trộn với 50µl cơ chất 2,2 DCPS ủ ở 30oC trong bể ổn nhiệt trong 10 phút. Sau đó bổ sung 250µl dịch chiết enzym thơ, ủ hỗn hợp trên ở 30o
C trong 5 phút. Mẫu gồm 1ml hỗn hợp phản ứng trên đƣợc hút ra theo các khoảng thời gian khác nhau để xác định lƣợng ion Cl- giải phóng ra theo phƣơng pháp Bergmann và
Sanik.Tiến hành song song với mẫu thí nghiệm là mẫu đối chứng đƣợc bổ sung HgSO4 1mM để bất hoạt enzym dehalogenase.
Phương pháp điện di khơng biến tính protein
Điện di khơng biến tính protein khơng làm mất hoạt tính enzym do đó ta có thể xác định đƣợc enzym có tồn tại trong dịch chiết hay khơng [21]. Bản gel điện di khơng biến tính đƣợc chuẩn bị theo phƣơng pháp Hardman và Slater [22].
Bảng 3. Thành phần của bản gel điện di khơng biến tính protein (gel 12%)
Thành phần Nồng độ gel tách (12%) Nồng độ gel cô (4%)
Acrymamide 12% 4%
Đệm Tris/sulphate 375mM 125mM
APS 0,05% 0,05%
TEMED 0,05% 0,05%
Quá trình điện di sử dụng hệ thống Mini-protean II của hãng Biorad,trong 300ml dung dịch đệm chạy có chứa 25mM Tris, 19mM đệm glycine (pH 8,3) ở điều kiện 200V, 4oC, trong thời gian 1 giờ. Mẫu đƣợc trộn với đệm với thành phần: 0,1% coomassie brilliant blue R250; 10% glycerol; 100mM DTT trong dung dịch Tris- acetate 50mM, pH 6,8.
Nhuộm bản gel không biến tính enzym dehalogenase
Bản gel có chứa dehalogenase khơng bị biến tính đƣợc ủ với cơ chất 2,2- DCP 50mM ở 30oC, pH 7,6 trong 30 phút. Sau đó rửa 2 lần với nƣớc cất khử trùng, bản gel đƣợc ủ trong hộp kín có chứa dung dịch AgNO3 0,1M cho đến khi xuất hiện băng. AgNO3 dƣ thừa bám trên bản gel sẽ đƣợc loại bỏ bằng cách rửa với nƣớc cất khử trùng, sau đó ngâm gel trong dung dịch acid acetic 5% trong 10 phút. Cuối cùng bản gel đƣợc rửa với nƣớc cất và bảo quản trong bóng tối.
Nguyên lý của phƣơng pháp điện di khơng biến tính dehalogenase là khi điện di protein sẽ nằm lại trong bản gel, gel sau đó đƣợc ủ với cơ chất 2,2 DCPS. Sản phẩm tạo ra có chứa ion Cl- nằm trong bản gel nên khi ủ với AgNO3 sẽ tạo thành AgCl kết tủa tạo thành băng tƣơng ứng với vị trí của enzym trên bản gel [21, 28, 17, 48].
Q Sepharose đƣợc nhồi lên cột Flex-Column 0,75cm. Sắc ký trao đổi anion đƣợc thực hiện bằng cách sử dụng một gradient tuyến tính của các ion phosphate. Các dung dịch đệm rất cần thiết trong quá trình tinh sạch enzym dehalogen. Bao gồm 1 hỗn hợp dung dịch đệm có nồng độ muối thấp (dung dịch đệm A) gồm: 5mM đệm phosphate pH 7,8; 1mM EDTA; 10% glycerol; 1mM DTT. Dung dịch đệm có nồng độ muối cao (dung dịch đệm B) gồm: 100mM đệm phosphate pH 7,8; 1mM EDTA; 10% glycerol; 1mM DTT. Hai dung dịch đệm A và B khi qua cột sắc ký sẽ đƣợc trộn lẫn với nhau bởi 1 gradient nồng độ làm cho dung dịch đệm qua cột có nồng độ tăng dần từ 5mM đến 100mM giúp đẩy các protein bám trên cột chảy ra ngoài [17, 24, 48].
5mg protein từ dịch chiết enzym thô sẽ đƣợc bổ sung lên cột, cột đƣợc điều chỉnh dòng chảy với tốc độ 1ml/phut. Sau khi dịch có chứa enzym dehalogenase chảy qua cột, cột sẽ đƣợc rửa với dung dịch đệm A đề loại bỏ các protein không bám vào cột cho đến khi OD 280nm đo đƣợc của dung dịch rửa gần bằng 0. Lúc này gradient dung dịch đệm A và B sẽ đƣợc cho chảy qua cột để tách các protein bám vào cột. Các phân đoạn đƣợc thu lại với thể tích 1ml/1phân đoạn đƣợc bảo quản trên đá lạnh để xác định hoạt tính enzym dehalogenase.
Phương pháp điện di SDS-PAGE
Các phân đoạn thu đƣợc sau khi chạy sắc ký sẽ đƣợc điện di biến tính protein để kiểm tra sự tồn tại và độ tinh sạch của enzym dehalogen. Dịch enzym qua cột đƣợc trộn với đệm mẫu có độ đậm đặc gấp 4 lần (Dye 4x) với thành phần (10ml): 100mM DTT, 4ml H2O, 40% glycerol, 8% SDS, 2,4% Tris, Coomasie Brilliant Blue 0,04g; 21µl dịch mẫu enzym sẽ đƣợc trộn với 7µl đệm mẫu, ủ ở 950C trong vòng 10 phút. Sau đó 25µl hỗn hợp sẽ đƣợc tra vào giếng trên bản gel rồi bổ sung dung dịch đệm chạy điện di. Quá trình điện di đƣợc thực hiện ở 150V cho đến khi dye chạy lên tới đỉnh của bản gel, cách đỉnh bản gel khoảng 1cm thì dừng lại [62].
Dung dịch đệm chạy điện di (5) 800ml:
- Tris base 12,08g - Glycine 57,6g
- SDS 4g - H2O 800ml
Dung dịch đệm chạy điện di đƣợc pha đậm đặc gấp 5 lần, do đó mỗi lần sử dụng sẽ đƣợc pha lỗng ra 5 lần để sử dụng.
Bảng 4. Thành phần bản gel SDS-PAGE
Gel tách (12%) Gel cô (4%)
H2O 1,25ml H2O 0,61ml Acrylamide (30%) 1,45ml Acrylamide (30%) 0,13ml 1.5M Tris HCl pH 8.8 0,925ml 0.5M Tris HCl pH 6.8 0,25ml SDS (10%) 37,5µl SDS (10%) 12,5µl APS 10% 37,5µl APS 10% 12,5µl TEMED 5µl TEMED 3µl
Nhuộm và tẩy bản gel SDS-PAGE
Bản gel SDS-PAGE sau khi đã điện di xong sẽ đƣợc nhuộm bởi dung dịch nhuộm để thuốc nhuộm bắt màu với protein có trong bản gel. Thành phần thuốc nhuộm gồm: 0,1 % Coomassie Blue R250 (w/w), 30 % methanol, 5 % acetic acid. Bản gel sẽ đƣợc nhuộm trong vòng 1 giờ và lắc nhẹ bằng máy lắc. Sau khi nhuộm bản gel xong có các phân tử Coomasie Blue bám khơng đặc hiệu lên bản gel do đó chúng cần đƣợc tẩy đi để quan sát đƣợc băng protein rõ nét hơn. Thành phần dung dịch tẩy gồm: 30 % methanol, 5 % acetic acid. Quá trình tẩy bản gel đƣợc lắc nhẹ bằng máy lắc diễn ra khoảng 1 giờ hoặc lâu hơn tùy thuộc vào độ rõ nét của băng protein trên bản gel [63].
Phương pháp sắc ký lọc gel
Để tinh sạch enzym dehalogen, mẫu enzym sau khi qua cột sắc ký trao đổi anion sẽ đƣợc tiến hành sắc ký lọc gel bằng gel Sephadex G-75. 0,5mg protein đƣợc sử dụng cho 1 lần chạy sắc ký, dung dịch đệm gồm 20mM Tris- acetate, 0,1M sodium acetate pH 7,5 đƣợc sử dụng để cân bằng và rửa cột sắc
ký. Tốc độ dòng chảy đƣợc điều khiển ở mức 0,5ml/phút, các phân đoạn đƣợc thu với thể tích 1ml [20].