3.4.1.Xây dựng đƣờng cong sinh trƣởng của chủng H11
Mẫu vi khuẩn sau các khoảng thời gian nuôi lắc 0, 3, 6, 9, 12, 24 giờ đƣợc tiến hành đo mật độ quang học tại OD600nm. Chúng tơi thu đƣợc kết quả trên hình 9. Đồ thị biểu hiện khả năng sinh trƣởng mạnh nhất của chủng H11 là ở khoảng thời gian sau 12 giờ ni cấy.
Hình 11. Khả năng sinh trƣởng của chủng H11 trên môi trƣờng MGB và MGB
0.1% cao nấm.
3.4.2.Tối ƣu các điều kiện cho sự sinh trƣởng của các chủng H11
Nhiệt độ
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hƣởng của nhiệt độ với các khoảng nhiệt độ từ 25 đến 45oC. Trong môi trƣờng MGB sau 1 ngày nuôi cấy chúng tơi nhận thấy dải nhiệt độ thích hợp cho sự sinh trƣởng của chủng H11 là 25 đến 37oC. Đây là khoảng nhiệt độ phù hợp với môi trƣờng phân lập cũng nhƣ các kết quả nghiên cứu phân lập các chủng vi sinh vật ở Việt Nam trƣớc đây trong điều kiện phân hủy các hợp chất độc hại [10,4].
0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.1 0.12 0.14 0.16 0 5 10 15 20 25 30 40 K h ả n ă n g s in h t ru ỏ n g O D 600 nm Nồng độ cơ chất (mM)
Hình 12. Khả năng sinh trƣởng của chủng H11 tại các nhiệt độ khác nhau trên môi
trƣờng MGB.
Nồng độ cơ chất
Nồng độ cơ chất có ảnh hƣởng hết sức quan trọng tới sự sinh trƣởng của chủng H11, với nồng độ quá cao sẽ gây ức chế các chủng, nếu quá thấp sẽ không tạo ra đƣợc khả năng sinh trƣởng tối đa.
Hình 13. Khả năng sinh trƣởng của H11 với các nồng độ cơ chất khác nhau trên
môi trƣờng MGB
Chúng tơi tiến hành nghiên cứu để tìm ra nồng độ cơ chất thích hợp nhất cho sự sinh trƣởng, phát triển của chủng vi khuẩn H11. Dải nồng độ cơ chất đƣợc sử dụng là từ 5 đến 40mM [25]. Sau 1 ngày nuôi cấy lắc, chúng tôi nhận thấy 25mM
2,2 DCPS là nồng độ tối ƣu nhất cho chủng H11. Kết quả này khá phù hợp cho việc ban đầu chúng tôi lựa chọn nồng độ cơ chất 20mM.
3.5.Khả năng phân hủy 2,2 DCPS
3.5.2.Khả năng phân hủy 2,2 DCPS theo thời gian
Đánh giá khả năng phân hủy hợp chất 2,2 DCPS theo thời gian là 0, 3, 6, 9,12, 24 giờ trên môi trƣờng MGB của chủng H11 chúng tôi thu đƣợc kết quả nhƣ sau:
Hình 14. Khả năng phân hủy theo thời gian của H11 trên môi trƣờng MGB
Sau 24 giờ tiến hành nuôi cấy chủng H11 trên môi trƣờng MGB chứa 25mM 2,2 DCPS. Hàm lƣợng Cl- đƣợc tạo ra trong môi trƣờng ni cấy là 70µM sau 24h, tƣơng đƣơng với 0,28% DCP bị phân hủy. Việc phân huỷ 2,2 DCPS của chủng H11 chƣa cao so với các nghiên cứu của Hong Jing và các cộng sự, chủng vi khuẩn trong nghiên cứu phân lập của tác giả đƣợc có khả năng phân hủy 3% - 10% 2,2 DCPS trong vịng 30 giờ ni cấy [25]. Lý giải cho sự thấp hơn này là do H11 và chủng vi khuẩn mà Hong Jing phân lập đƣợc là 2 chủng vi khuẩn khác nhau do đó có thể chúng có khả năng phân hủy 2,2 DCPS khác nhau, mặt khác chủng H11 cũng chƣa đƣợc tối ƣu các điều kiện nghiên cứu cũng nhƣ hàm lƣợng 2,2 DCPS đƣa vào trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn so với các nghiên cứu trƣớc đây.
3.6. Bƣớc đầu nghiên cứu tinh sạch dehalogenase từ chủng H11 3.6.2. Xác định hoạt tính enzym dehalogen 3.6.2. Xác định hoạt tính enzym dehalogen
3.6.3. Sắc ký trao đổi anion
Để xác định kích thƣớc và tinh sạch dehalogenase có trong chủng H11 chúng tơi tiến hành kỹ thuật sắc ký trao đổi anion sử dụng gel Q sepharose.
Sau khi tiến hành chạy sắc ký chúng tơi thu đƣợc 20 phân đoạn có chứa các protein có kích thƣớc khác nhau. Tiến hành thử hoạt tính các phân đoạn thu đƣợc chúng tơi nhận thấy có 2 phân đoạn có hoạt tính dehalogenase cao có trong các phân đoạn thứ 8, 10. Cịn các phân đoạn cịn lại hầu nhƣ khơng có hoạt tính hoặc rất yếu.
Xác định hoạt tính 2 phân đoạn trên chúng tơi thu đƣợc kết quả sau:
Bảng 7. Hoạt tính enzym dehalogen của chủng H11
Tổng lƣợng protein (mg/ml) Hoạt độ enzym (µmol/min) Hoạt tính riêng (Unit/mg) Phân đoạn thứ 8 0,0057 0,006 1,05 Phân đoạn thứ 10 0,0095 0,0044 0,46 Dịch thô 0,178 0,0063 2,84
Để kiểm tra mức độ tinh sạch của các phân đoạn thu đƣợc chúng tôi tiến hành điện di các phân đoạn trên gel SDS-PAGE với thành phần 12% gel tách và 4% gel cô để kiểm tra độ tinh sạch của enzym sau khi qua cột sắc ký.
Hình 15. Kết quả điện di SDS-PAGEsau khi qua cột Q sepharose. Trong đó, M:
marker protein. Các giếng 1-9: là số thứ tự phân đoạn thu đƣợc sau khi sắc ký qua gel Q sepharose.
Từ kết quả điện di cho thấy ở làn thứ 3 và 4 (tƣơng ứng với phân đoạn thứ 8 và 10 sau khi sắc ký qua gel Q sepharose) có xuất hiện băng có kích thƣớc khoảng 31kDa và 36kDa đậm hơn so với các phân đoạn khác, tuy nhiên độ tinh sạch của enzym vẫn chƣa cao còn xuất hiện một số băng nhiễu. Các phân đoạn khác hàm lƣợng protein ở vạch tƣơng ứng còn thấp. Mặc dù phân đoạn thứ 8 và 10 có tồn tại hoạt tính enzym dehalogenase và có xuất hiện băng protein có kích thƣớc khoảng 31 và 36kDa tuy nhiên chúng tôi chƣa xác định đƣợc enzym dehalogenaseđƣợc sinh ra bởi vi khuẩn Alcaligenes faecalis_H11 có kích thƣớc chính xác là bao nhiêu kDa. Trƣớc đây enzym dehalogenase có khả năng phân hủy hợp chất 2,2 DCPS đƣợc tách ra từ Methylobacterium sp. HJ1 có kích thƣớc 36kDa và là 1 protein dimer, từ
Rhizobium sp. có kích thƣớc 62.000Da [20,15]. Do đó để xác định kích thƣớc
enzym dehalogen đƣợc sinh ra bởi vi khuẩn Alcaligenes faecalis_H11 chúng tôi tiến hành phƣơng pháp điện di khơng biến tính protein để xác định chính xác kích thƣớc của enzym.
3.6.4. Điện di khơng biến tính protein
Để xác định enzym dehalogenase có khả năng phân hủy cơ chất hay khơng cũng nhƣ xác định kích thƣớc của enzym dehalogenase chúng tơi tiến hành điện di khơng biến tính phân đoạn chứa thứ 8 và 10 enzym. Sau đó ủ bản gel với cơ chất và tiến hành nhuộm bạc. Kết quả thu đƣợc là có sự tồn tại của enzym dehalogenase trong phân đoạn thu đƣợc.
Hình 16. Điện di khơng biến tính protein. M: marker protein; E: enzym
dehalogenase thu đƣợc từ phân đoạn thứ 8 và 10 sau khi sắc ký qua gel Q sepharose.
Từ kết quả điện di khơng biến tính protein cho thấy enzym dehalogenase đƣợc sinh ra bởi vi khuẩn Alcaligenes faecalis_H11 có kích thƣớc khoảng 72kDa,
tuy nhiên kích thƣớc của enzym trên bản điện di SDS-PAGE lại là 36kDa, điều này chứng tỏ đây là một protein dimer. Giống với enzym dehalogen đƣợc sản sinh từ
Methylobacterium sp. HJ1.
3.6.5. Sắc ký lọc gel
Để loại bỏ các băng nhiễu quanh băng có kích thƣơc 36kDa chúng tơi sử dụng kỹ thuật sắc ký lọc gel với các phân đoạn đã qua cột sắc ký trao đổi ion. 2ml dịch đã qua cột mono Q đƣợc tra vào cột gel Sephadex G75. Các phân đoạn đƣợc thu với thể tích 1ml. Vì lƣợng protein trong mẫu thấp lại bị pha loãng rất nhiều lần nên sau khi thu các phân đoạn lọc gel chúng tôi không tiến hành xác định đƣợc hàm lƣợng protein có trong mẫu cũng nhƣ khơng xác định đƣợc hoạt tính enzym trong các phân đoạn này. Tiến hành chạy điện di các phân đoạn sau khi lọc gel chúng tơi thu đƣợc kết quả sau:
Hình 17. Kết quả điện di SDS-PAGE sau khi qua cột Sephadex G-75.
M: marker protein; dịch thô: hai phân đoạn 8 và 10 sau khi qua cột sắc ký qua gel Q sepharose; các giếng 1-5: là các phân đoạn thu đƣợc sau khi lọc gel.
Sau khi qua cột sắc ký lọc gel enzym dehalogen đã đƣợc tinh sạch hơn ở 2 làn thứ 1 và 2 (tƣơng ứng với phân đoạn thứ 6 và 8 sau khi qua sắc ký lọc gel). Các băng chứa protein không quan tâm đã giảm đi rất nhiều, điều này chứng tỏ enzym dehalogen có kích thƣớc 36kDa gần nhƣ đã đƣợc tinh sạch ở phân đoạn thứ 6 và 8 sau khi lọc gel.
Các phân đoạn có chứa protein đƣợc thu thập trong khoảng 20 phân đoạn đầu tiên sau khi chạy qua cột sắc ký trao đổi anion Q sepharose. Các phân đoạn này sẽ đƣợc kiểm tra hoạt tính để xác định xem có sự tồn tại của enzym dehalogen hay khơng. Trong đó có 2 phân đoạn thứ 8 và 10 có hoạt tính enzym mạnh nhất. Sau đó tiến hành phân tích SDS-PAGE để kiểm tra độ tinh sạch của enzym thu đƣợc. Đồng thời chúng tơi phân tích trên một bản gel khơng biến tính phân đoạn chứa enzym để xác định chính xác kích thƣớc của enzym. Sau đó chúng tơi phải tiến hành chạy thông qua cột thứ hai bằng gel Sephadex G-75 để tinh sạch protein có kích thƣớc 36kDa.
Ngồi protein kích thƣớc 36kDa mà chúng tơi quan tâm cịn có sự xuất hiện của một protein có kích thƣớc khoảng 31kDa cũng có khả năng hình thành enzym dehalogenase đã đƣợc Fahrul huyop và Ronald cooper phân lập [22].
Enzym có khả năng phân hủy 2,2 DCPS từ chủng H11 có kích thƣớc khoảng 36kDa đã đƣợc tinh sạch bƣớc đầu. Các nghiên cứu cần tiếp tục để tinh sạch và nghiên cứu cụ thể hơn về enzym này là rất cần thiết, cũng nhƣ tìm hiểu về tính chất của enzym phân lập.
KẾT LUẬN
1. Phân lập đƣợc 20 chủng vi sinh vật trên mơi trƣờng có bổ sung 2,2 DCPS là nguồn cacbon, các khuẩn lạc chủ yếu có hình trịn, kích thƣớc khoảng từ 0,5-5mm. Đa số có màu trắng trong hoặc trắng đục, một số có màu vàng nhạt hoặc vàng chanh. Trong đó chủng vi khuẩn H11 có hoạt tính mạnh nhất và là vi khuẩn gram âm. Quan sát ảnh chụp hiển vi điện tử quét, chủng H11 có dạng que ngắn, bề mặt xù xì đƣờng kính sợi tế bào là khoảng 1,5µm, chiều dài tế bào là khoảng 3µm
2. Dựa vào hình thái khuẩn lạc, tế bào và kết quả phân tích trình tự gen 16S rRNA cho thấy chủng H11 tƣơng đồng 99,23 % (1419/1430 bp) với trình tự gen rARN 16S của Alcaligenes faecalis_D88008. Điều kiện sinh trƣởng tối ƣu của chủng H11 trong khoảng nhiệt độ 25-37oC, nồng độ cơ chất là 25mM. Alcaligenes faecalis_H11 có khả năng sử dụng nhiều loại cơ chất khác nhau các loại đƣờng đơn
nhƣ Glucose, Arabinose,...
3. Sau 24 giờ tiến hành nuôi cấy chủng Alcaligenes faecalis_H11 trên
môi trƣờng MGB chứa 25mM 2,2 DCPS. Hàm lƣợng Cl-
đƣợc tạo ra trong môi trƣờng ni cấy là 70µM sau 24h, tƣơng đƣơng với 0,28% DCP bị phân hủy
4. Bƣớc đầu tinh sạch enzym dehalogenase từ chủng H11 có kích thƣớc 36kDa, và là một dimer protein.
KIẾN NGHỊ
Mục đích của nghiên cứu này là tinh sạch và nghiên cứu tính chất enzym dehalogenase từ chủng vi sinh vật phân lập tại Việt Nam. Ngoài những kết quả đã đạt đƣợc thì các nghiên cứu tiếp theo sâu hơn về đề tài này là rất cần thiết nhƣ:
1. Tối ƣu điều kiện sinh trƣởng của H11 trên cơ chất 2,2 DCPS trong thời gian dài hơn. Đánh giá sự ảnh hƣởng của một số yếu tố kim loại nặng lên sự sinh trƣởng của H11.
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt:
1. Đào Hùng Cƣờng, Nguyễn Minh Thiên, Nguyễn Trần Nguyên (2008), ―Nghiên cứu xác định một số hợp chất clo trong nƣớc mặt, trong đất thuộc địa bàn thành phố Đà Nẵng‖, Tạp chị Khoa học và Công nghệ, Đại học Đà Nẵng, 6(29), tr. 57-58. A9
2. Kiều Hữu Ảnh (2006), Giáo trình vi sinh vật học phần 1, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr. 81-82. (36)
3. Lê Bảo Hƣng (2012), ―Nghiên cứu điều kiện phân tích các hợp chất hữu cơ clo PCB trong mẫu môi trƣờng bằng phƣơng pháp GC-MS‖, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 39
4. Ngơ Thị Kim Tốn (2012), Nghiên cứu phân lập tuyển chọn các chủng vi sinh
vật ứng dụng xử lý nước thải giàu nitơ, photpho, luận văn thạc sỹ sinh học
thực nghiệm, Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN, 46-47. (56)
5. Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007), ―Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử loại clo Dehalococcoides trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCR-DGGE‖, Tạp chí Nơng nghiệp và Phát triển nông thôn, 16, tr.
41-45.
6. Nguyễn Thị Kim Cúc; Phạm Việt Cƣờng; Nguyễn Thị Tuyết Mai (2000), ―Một số tính chất của vi khuẩn phân huỷ methyl parathion phân lập từ các mẫu đất tại Hà Nội‖, Hội nghị sinh học quốc gia: Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong sinh học, Hà Nội, 29-34
7. Nguyễn Tuấn Khanh (2010), Đánh giá ảnh hưởng của sử dụng hóa chất bảo vệ thực vật đến sức khỏe người chuyên canh chè tại Thái Nguyên và hiệu quả của các biện pháp can thiệp, luận án tiến sỹ Y học, trƣờng Đại học Thái
Nguyên. (G)
8. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Giáo trình hóa sinh học thực nghiệm, Nxb Giáo Dục Việt Nam. Tr 38-40 (40)
9. Trần Thị Vân Thi (2007), ―Đánh giá sự tồn dƣ và tích lũy của các hợp chất ơ nhiễm chứa clo khó phân hủy tại các vùng cửa sông và đầm phá Thừa Thiên
Huế, miền Trung Việt Nam‖, Báo cáo Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Châu Á, ĐHQGHN. A8
10. Trần Thúy Hằng (2011), Phân lập, nghiên cứu đặc điểm sinh học của một số chủng vi sinh vật có khả năng tạo màng sinh vật (biofilm) ở Việ tNam, luận
văn thạc sĩ khoa học, Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. (55)
11. Hà Minh Trung (2000), Nghiên cứu ảnh hưởng của hoá chất độc hại dùng trong nông nghiệp tới sức khoẻ con người, các biện pháp khắc phục, Viện Bảo
Vệ Thực Vật, 1-3.
Tiếng Anh
12. (1987), ―Dalapon health advisory office of drinking water‖, U.S. Environmental protection agency, 1-12.
13. (2008), ―Pesticides‖, Children's Health and the Environment.
14. Bergmann JG. , John S (1957), ―Determination of trace amounts of chlorine in naphtha‖, Analytical Chemistry, 29 (2), pp 241–243.
15. Dwivedi AH and Pande UC (2011), ―Photochemical degradation of halogenated compounds: A review‖, Scientific reviewsand Chemical Communications: 2(1), 41-65.
16. Eleanor KM, Berry AN and Skinner AJ (1978), ―Degradation of the selective herbicide 2,2-Dichloropropionate (Dalapon) by a soil bacterium‖,
JournalofGeneralMicrobiology110, 39-45.
17. Fahrul ZH and Ronald C (2012), ―Degradation of millimolar concentration of the herbicide dalapon (2,2-Dichloropropionic acid) by rhizobium sp isolated
from soil‖, Biotechnol & Biotechnol, 26(4), pp. 3106-3107.
18. Fetzner S and Ligens F, 1994.―Bacterial dehalogenases: Biochemistry, genetics, and biotechnological application‖,Microbiol.Rev 58 (4):641-685 19. Gordon WG (1994), "Natural Organohalogens—Many More Than You
20. Greaves MP, Davies HA, Marsh JA, Wingfield GI (1981), ―Effects of pesticides on soil microflora using dalapon as an example‖. Arch Environ Contam Toxicol, 10(4):437-49.
21. Hamid. A, Hamdan S, Ariffin SHS, and Huyop F (2010), ―Molecular prediction of dehalogenase producing microorganism using 16S DNA analysis of 2,2-dichloropropionate degrading bacterium isolated from volcanic soil‖,
Journal of Biological Sciences, Vol. 10, pp. 190-199.
22. Hardman DJ and JH Slater (1981), ―Dehalogenases in soil bacteria‖, J. Gen. Microbiol., pp. 117-128
23. Hareland WA, Crawford RL, Chapman, PJ and Dagley S (1975). ―Metabolic function and properties of a 4-hydroxyphenyl acetic acid 1-hydroxylase from
Pseudomonasacidovorans‖. JournalofBacteriology121, 272-285.
24. Hirsch P, Alexander M (1960), ―Microbial decomposition of halogenated propionic and acetic acids‖, Can J Microbial, 6, pp. 241-249.
25. Iwaji I, Satori U, Takejiro O (1952), ―New colorimetric determination of chloride using mercuric thiocyanate and ferric ion‖, Bulletin of The Chemical Society of Japan, 25(3): pp. 226-226.
26. Janssen DB, Dinkla IJ, Poelarends GJ, and Terpstra P (2005), ―Bacterial
degradation of xenobiotic compounds: evolution and distribution of novel enzyme activities‖, Environ. Microbiol. 7:1868–1882.
27. Jensen HL, Gemmell CG (1964). ―Some studies on trichloroacetate- decomposing soil bacteria‖. ArchivfürMikrobiologie, 48:386-392.
28. Jing NH, Sulaiman FH, Wahab RA, Pakingking JR & Huyop F (2008). ―Purification and properties of a non-stereospecific dehalogenase enzyme E (DehE) from Methylobacterium sp. HJ1‖. African Journal of Microbiology Research, 2(7), 187-191.
29. John H. Montgomery(1997), Agrochemicals Desk Reference, 2nd , CRC Press, USA, pp: 126.
30. Kimura M. (1980), ―A simple method for estimating evolutionary rate of base substitutions through comparative studies of nucleotide sequences‖, J Mol