CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp
2.2.8. Chuyển gen vào giống lúa Kitaake sử dụng Agrobacterium
Quy trình chuyển gen gồm các bước cơ bản: tạo mơ sẹo, đồng ni cấy mơ sẹo với dịng vi khuẩn mang vector chuyển gen, chọn lọc mô sẹo chuyển gen, tiền tái sinh và tái sinh mô sẹo (Hình 13).
Các dịng vi khuẩn Agrobacterium mang các cấu trúc chuyển gen
PC5300.OE-ANK1, PC5300.OE-ANK2, Cas9-ANK1, Cas9-ANK2, Cas9-ANK1,2, và hai vector rỗng sử dụng làm đối chứng PC5300.OE-Ø (PC5300.OE khơng mang trình tự mã hóa gen), PDS (PRGEB32 không mang cấu trúc PTG) được sử dụng đồng nuôi cấy với mô sẹo Kitaake tạo các cây chuyển gen. Các mơi trường ni cấy được trình bày ở phần phụ lục.
Hình 13. Các bước cơ bản trong q trình chuyển gen thơng qua Agrobacterium ở lúa
Tạo mô sẹo (30 – 35 ngày): Hạt lúa được khử trùng đặt trên bề mặt môi trường tạo mô sẹo NB-IND, nuôi cấy ở 280C, độ ẩm 70%, tối. Sau 28 ngày, chuyển mô sẹo sang môi trường NB-IND mới, nuôi cấy ở 28oC, trong tối, độ ẩm 70%, 7 – 10 ngày.
Đồng nuôi cấy (3 ngày): Dịch vi khuẩn Agrobacterium được nuôi cấy trên bề mặt môi trường AB, 3 ngày trong tối ở 280C. Thu khuẩn và hịa tan khuẩn trong mơi trường đồng ni cấy lỏng R2-CL bổ sung acetosyringone 100 µM. Cho 25 ml dịch khuẩn vào đĩa petri đã có sẵn các mô sẹo lựa chọn chuyển gen, ngâm trong 10 phút rồi loại bỏ dịch khuẩn. Thấm khô và chuyển mô sẹo lên môi trường đồng nuôi cấy R2-CS-AS, 10 mô sẹo/đĩa, và nuôi cấy trong tối, 250C trong 3 ngày.
Chọn lọc mô sẹo kháng kháng sinh (21 – 30 ngày): Sau 3 ngày đồng nuôi cấy, đặt 10 mô sẹo/đĩa môi trường chọn lọc I (R2-S), nuôi cấy trong tối, ở 280C, độ ẩm 70%, 7 – 10 ngày. Sau đó chuyển mơ sẹo sang mơi trường chọn lọc II (NB-S), điều kiện nuôi cấy không thay đổi.
Tiền tái sinh (7 ngày): Các mơ sẹo sống sót được chuyển sang môi trường tiền tái sinh PRN, 6 mô sẹo/đĩa, nuôi cấy trong tối, ở 280C, độ ẩm 70%, 7 ngày.
Tái sinh (30 – 35 ngày): Các mô sẹo được chuyển sang môi trường tái sinh RN với 5 mô sẹo/đĩa, nuôi cấy trong điều kiện 280C, sáng/tối: 16h/8h, độ ẩm 70%,
trường nuôi cấy (MS) trong điều kiện 280C, sáng/tối:16h/8h, độ ẩm 70% (10 – 14 ngày). Sau 7 – 10 ngày, cây đạt chiều cao 12 – 17cm, có thể tiến hành các thí nghiệm đánh giá tiếp theo.