CHƯƠNG 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2. Phương pháp
2.2.9. Phân tích cây chuyển gen mang cấu trúc tăng cường biểu hiện ANK1, ANK2
ANK2
*Sàng lọc cây chuyển gen thế hệ T0
Để kiểm tra sự có mặt của T-DNA trong cây tái sinh, phản ứng PCR được thực hiện trên gDNA, với cặp mồi được thiết kế khuếch đại một vùng trình tự của gen HPT (HPT-OE-F, HPT-OE-R: Bảng 1) sử dụng Dream Taq DNA polymerase Kit (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các dịng chuyển gen có băng DNA đúng với kích thước mong đợi (999 bp) được kiểm tra trình tự T-DNA chèn vào hệ gen bằng phản ứng PCR với cặp mồi pUBI và pCaMV35S, sản phẩm của phản ứng được giải trình tự và so sánh với trình tự tham chiếu.
*Sàng lọc cây chuyển gen T1 mang 1 bản sao T-DNA bằng qRT-PCR
Số lượng bản sao của T-DNA trong các dòng lúa chuyển gen T1 được đánh giá bằng kỹ thuật qRT-PCR theo mô tả của Zhang và cộng sự [50]. Phản ứng qRT- PCR được thực hiện với khuôn là gDNA được tách chiết từ lá, sử dụng cặp mồi đặc hiệu HPT-CDS-F, HPT-CDS-R bắt cặp trong vùng gen HPT. Sử dụng gen SPS
(Sucrose phosphate synthase) chỉ có 1 bản sao trong hệ gen lúa làm gen tham chiếu nhằm xác định số lượng bản sao T-DNA. Số lượng bản sao T-DNA được đánh giá dựa vào tỷ lệ bản sao so với gen tham chiếu, theo công thức:
Ratio=2Ct reference−Ct transgene
Trong đó, Ct reference là chu kỳ ngưỡng của gen tham chiếu SPS, Ct transgene là chu kỳ ngưỡng của gen HPT.
Nếu tỷ lệ này = 1: cây chuyển gen chỉ mang 1 bản sao T-DNA và đồng hợp tử. Nếu tỷ lệ là 0,5: cây chuyển gen chỉ mang 1 bản sao T-DNA nhưng dị hợp tử. Tỷ lệ lớn hơn 1: cây mang nhiều hơn 1 bản sao T-DNA.
*Đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK1, ANK2 ở các cây chuyển gen T1 bằng qRT-PCR
Biểu hiện của gen trong cây chuyển gen được đánh giá bằng kỹ thuật qRT-PCR sử dụng khuôn là cDNA . Các cặp mồi sử dụng cho các gen ANK1 (CDS-ANK1-F,
CDS-ANK1-R), ANK2 (CDS-ANK2-F, CDS-ANK2-R) và gen tham chiếu ACTIN
(Actin-F, Actin-R) được trình bày ở bảng 1.
Mức độ biểu hiện tương đối của gen giữa cây chuyển gen và cây đối chứng được đánh giá theo cơng thức:
Trong đó, Etarget, Eref lần lượt là giá trị E của các mồi dùng cho gen đích và gen đối chứng; ΔCPtarget(control-sample), ΔCPref(control-sample) lần lượt là hiệu số chu kỳ ngưỡng của gen đích và gen tham chiếu ở cây đối chứng và cây chuyển gen [36].
Phân tích thống kê bằng phương pháp Student-ttest với p<0,05 .
2.2.10. Chọc lọc các dịng chuyển gen đột biến bằng cơng nghệ CRISPR/Cas9
Các cây tái sinh T0 từ quá trình chuyển gen với Agrobacterium mang cấu trúc
CRISPR/Cas9 được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi HPT-F và HPT-R (Bảng 1) sử dụng “Dream Taq DNA polymerase Kit” (Thermo scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Sau đó các dịng dương tính được kiểm tra đột biến bằng phản ứng PCR với cặp mồi được thiết kế bên ngoài 2 gRNA của mỗi gen (Hình 14), sử dụng “Phusion II High Fidelity DNA polymerase Kit” (F-549S/L, Thermo Scientific, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm PCR được giải trình tự và phân tích bằng phần mềm CRISP-ID hoặc DSDecodeM để phát hiện đột biến. Các dòng đột biến xác định được từ thế hệ T0, hoặc tiếp tục tìm kiếm ở thế hệ T1 bằng phương pháp PCR như trên.
Hình 14. Vị trí cặp mồi nhằm xác định đột biến xảy ra ở các dòng chuyển gen Cas9-ANK1, Cas9-ANK2
2.2.11. Các kỹ thuật khác
* Biến nạp plasmid vào vi khuẩn E.coli bằng phương pháp sốc nhiệt
50 µl tế bào khả biến E.coli TOP10 (INTROGEN) được rã đông trên đá (5
phút). Bổ sung 2 µl plasmid, trộn đều nhẹ nhàng và ủ trong đá 30 phút. Quá trình gây sốc nhiệt được tiến hành trong bể ổn nhiệt ở 42°C, 50 giây rồi ngay lập tức làm lạnh ống vi khuẩn trong đá 5 phút. Nuôi phục hồi vi khuẩn trong LB lỏng ở 370C, 200 vòng/phút trong vòng 1 giờ. Trải đều 100 µl và 200 µl dịch khuẩn trên bề mặt môi trường sinh trưởng LB (25 ml) bổ sung 100 mg/l Ampicillin, 100 µl IPTG (100 mM) và 20 µl X-Gal (50 mg/ml), ni cấy qua đêm ở nhiệt độ 370C. Sau đó, đĩa ni cấy được đặt ở 40C trong 2 giờ nhằm tăng sự khác biệt chọn lọc màu xanh/ trắng. Các khuẩn lạc màu trắng được chọn lọc, tiếp tục nuôi cấy trong 5 mL môi trường LB lỏng và 100 mg/l ampiciline, lắc 200 vòng/phút qua đêm ở 37°C để tách chiết DNA plasmid.
*Biến nạp plasmid vào vi khuẩn A. tumefaciens bằng phương pháp sốc điện
50 µl tế bào vi khuẩn EHA105 được làm tan hoàn toàn trong đá lạnh sau khi lấy từ -800C, trộn đều vi khuẩn với 2 µl plasmid, chuyển hỗn hợp sang cuvette 2 mm (đã được làm lạnh trước đó) (BTX Harvard apparatus). Tiến hành sốc điện sử dụng dòng điện 1800 V, 200 Ʊ, 25 µF với máy sốc điện ECM 399 Electroporation
System, BTX Harvard apparatus. Tế bào vi khuẩn sau khi sốc điện được ni hồi phục trong 950 µl LB lỏng ở 280C, lắc 200 vòng/phút trong vòng 2 giờ. 50 – 100 µl dịch khuẩn được trải đều lên đĩa môi trường LB bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/l) và rifamycin (25 mg/l), chọn lọc khuẩn lạc dương tính sau 48 giờ nuôi khuẩn ở 280C. Các khuẩn lạc xuất hiện được chọn ra và tiếp tục nuôi trong ống Flacon 50 ml chứa 5 ml môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh kanamycin (50 mg/l) và rifamycin (25 mg/l), lắc 200 vòng/phút, qua đêm ở 280C để tách chiết plasmid.
*Tách chiết plasmid
Tất cả các plasmid từ E.coli và A. tumefaciens đều được tách chiết bằng kit
GeneJET Plasmid Miniprep Kit dựa trên phương pháp ly giải bằng ankaline kết hợp với một màng silica tinh sạch (#K0503, Thermo Scientific, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Plasmid thu được khi rửa giải màng tinh sạch với 50µl dung dịch Elution Buffer và được lưu giữ ở -200C.
*Cắt DNA bằng enzyme giới hạn
Các phản ứng cắt DNA plasmid bằng enzyme giới hạn được thực hiện với các kít của hãng Thermo Fisher Scientific bao gồm enzyme và dung dịch đệm thích hợp. Theo hướng dẫn của nhà sản xuất, mỗi phản ứng được thực hiện trong thể tích 20 µl bao gồm DNA, enzyme giới hạn và dung môi. Các phản ứng cắt trong đề tài này sử dụng các enzyme EcoRI, BamHI, SalI, BsaI, FokI hoạt động tối ưu ở 370C. Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 370C trong 1 giờ, sau đó được kiểm tra bằng cách điện di trên gel agarose.
* Điện di
Gel agarose (#R0492, Fermentas) được pha trong đệm 0.5 X TRIS-Acetate- EDTA (TAE) nồng độ 0,7% - 3%, tùy thuộc vào kích thước DNA. Bản gel được đặt trong bể chứa dịch đệm TAE 0.5 X. Các mẫu được trộn với thuốc nhuộm Loading dye (#R0611, Fermentas, USA) với tỉ lệ thích hợp sau đó được cho vào giếng điện di trên gel, chạy điện di ở 100 V – 40 phút. Bản gel sau đó được nhuộm trong dung dịch Ethidium Bromide (0,5 µg/ml) trong vịng 20 phút, rửa lại trong bể nước cất 10
phút và soi trong buồng UV (Uvltec, Cambridge) và phần mềm Fire Reader. Các thí nghiệm điện di sử dụng thang chuẩn DNA Gene Ruler 1kb (#SM1163, Fermentas).
* Các phản ứng khuếch đại DNA (PCR)
Các phản ứng PCR trong quá trình phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2: Sử dụng “Phusion II High Fidelity DNA polymerase Kit” (F-549S/L,
Thermo Scientific, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Các phản ứng PCR được thực hiện trong thể tích 50 µl bao gồm 50 ng khuôn DNA, 0,1mM dNTPs (#R0182, Fermentas, ThermoScientific, USA), 0,1 µM mỗi mồi đặc hiệu (mồi xi và mồi ngược), 10 µL dịch đệm 5 X Phusion HF Buffer, 0,5 µl Phusion Hot StartII DNA polymerase (2 U/µl) và bổ sung thêm nước cất hai lần. Một phản ứng PCR được tiến hành theo chu trình nhiệt: 98ºC – 30 giây và tiếp tục với 35 chu kỳ “ tách mạch 98ºC – 10 giây, gắn mồi Ta – 30 giây, và kéo dài mạch thực hiện ở 72ºC – 30 giây cho đoạn khuếch đại 1kb”, sản phẩm được ổn định ở 72ºC – 10 phút và giữ ở 200C – 10 phút.
Các phản ứng PCR sàng lọc khuẩn lạc: Sử dụng “Dream Taq DNA polymerase” (Thermo Scientific) với thể tích phản ứng 20µl. Phản ứng được tiến hành với chu trình nhiệt: 94ºC – 5 phút hoạt hóa Dream Taq DNA polymerase, 30 chu kỳ nhiệt “94ºC – 30 giây, Ta – 30 giây nhiệt độ gắn mồi , kéo dài mạch ở 72ºC – 1 phút cho 1kb”, ổn định sản phẩm ở 72ºC– 1 phút và giữ sản phẩm ở 10 phút– 25ºC. Một phản ứng PCR bao gồm 10 X Dream Taq Buffer (#R0971, Fermentas, USA), 0,5 µl dNTPs (10 mM) (#R0182, Fermentas, USA), 0,5 µl mỗi mồi (10 µM – mồi xi và mồi ngược), 0,1 µl Dream Taq DNA polymerase (#EP0702) và nước cất.
Các phản ứng PCR kiểm tra plasmid, cây chuyển gen: Các phản ứng PCR kiểm tra plasmid và cây chuyển gen được thực hiện tương tự như ở các khuẩn lạc trong đó sử dụng 20 ng mẫu khuôn DNA thay thế cho mẫu khuẩn lạc.
Các phản ứng PCR được thực hiện trên máy Prime Thermal Cyclers (Bibby Scientific Limited, UK).
Phản ứng qRT-PCR được thực hiện trong thể tích 10 µl sử dụng kit GoTaq qPCR Master Mix (Promega). Sử dụng đối chứng âm là mẫu nước và gen ACTIN
(Os01g73310) là gen tham chiếu.
Hiệu suất của mồi được tính tốn bằng cách xây dựng đường chuẩn (StDNAard curve). Pha loãng mẫu cDNA theo hệ số pha loãng 10 (1/10, 1/20, 1/40, 1/80, 1/160, 1/320). Đường chuẩn cho mỗi cặp mồi được xây dựng với các giá trị Ct thu được ở 6 nồng độ pha loãng như trên. Hai thông số được hiển thị trên mỗi đường chuẩn để đánh giá hiệu quả PCR E (Efficiency) và hệ số tương quan R2. E được tính theo cơng thức của Pfaffl E=10^-(1/slope) [36]. Trong đó slope là giá trị a trong phương trình biểu diễn đường chuẩn y= ax+b. Hiệu suất của mồi tốt, đủ điều kiện để thực hiện phản ứng qRT-PCR nếu 1,8 < E < 2,2 và giá trị R2 >0,9.
Phản ứng qRT-PCR được thực hiện trên máy Agilent Technologies Mx 3005p (Stratagene) với chu trình như sau: 95°C trong 10 phút để kích hoạt enyme, 40 chu kỳ của 95°C (15 giây) và 60°C (1 phút).
*Giải trình tự và phân tích dữ liệu
Tất cả các plasmid, sản phẩm PCR được giải trình tự DNA theo phương pháp Sanger tại Macrogen (Hàn Quốc) với các cặp mồi trình bày ở bảng 1 tương ứng cho từng thí nghiệm.
Sử dụng các phần mềm phân tích tin sinh như BioEdit hay BLAST/NCBI để phân tích, so sánh các trình tự nhân dịng với các trình tự tham chiếu của gen hay của các gRNA thiết kế. Các công cụ CRISP-ID/DSDecodeM được dùng để tìm kiếm các đột biến gây ra bởi CRISPR/Cas9 ở các cây chuyển gen.
Sử dụng các công cụ ExPASy, SMART để phân tích trình tự và motif cấu hình các chuỗi polypeptide.
Các đồ thị, số liệu thống kê của nghiên cứu được xây dựng trên phần mềm thống kê R.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vector chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2
3.1.1. Phân lập trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2
Q trình phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 từ cDNA tổng số của mẫu bông non giống lúa Nipponbare được thực hiện bằng 3 phản ứng PCR lồng. Phản ứng PCR vòng 1 được thực hiện với cặp mồi thiết kế bắt cặp ở vùng 3’-UTR và 5’-UTR của mỗi gen, kích thước mong đợi của sản phẩm PCR1 là 1342 bp và 1378 bp tương ứng cho 2 gen ANK1 và ANK2. Kết quả điện di sản phẩm PCR1 cho thấy 1 băng DNA gần đúng với kích thước mong đợi của gen ANK2 trong khi đó
khơng quan sát được băng tương tự cho gen ANK1 (Hình 15A). Biểu hiện của gen ANK1 được báo cáo ở mức độ rất thấp ở giai đoạn hình thành bơng non, do đó
lượng sản phẩm PCR1 khơng đủ để quan sát trên gel điện di, tuy nhiên vẫn có thể sử dụng để tiếp tục khuếch đại ở các phản ứng vòng trong.
Phản ứng PCR vòng 2 sử dụng cặp mồi bắt cặp ở hai đầu vùng trình tự mã hóa mỗi gen nhằm phân lập tồn bộ đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2. Hình
ảnh điện di cho thấy sản phẩm PCR2 của cả 2 gen không đặc hiệu, tuy nhiên có băng DNA có kích thước gần như mong đợi 909 bp và 1116 bp (Hình 15B). Băng DNA đặc hiệu sau đó được cắt ra khỏi gel và tinh sạch để sử dụng làm khn cho phản ứng PCR3.
Phản ứng PCR vịng 3 nhằm gắn thêm đoạn trình tự attB1 (29 bp), attB2 (30 bp) vào đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 phục vụ gắn chúng vào vector
PC5300.OE. Hình ảnh điện di sản phẩm của phản ứng PCR3 cho thấy 2 băng đặc hiệu gần đúng với kích thước mong đợi của gen ANK1 là 968 bp và gen ANK2 là 1175 bp (Hình 15C).
Hình 15. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phân lập đoạn trình tự mã hóa gen
ANK1 và ANK2
A: sản phẩm PCR vòng 1. B: sản phẩm PCR vòng 2. C: sản phẩm PCR vòng 3. L: Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
3.1.2. Nhân dịng trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector nhân dòng pGEM-T Easy pGEM-T Easy
Sản phẩm PCR3 sau khi được tinh sạch và gắn thêm adenin được đưa vào vector pGEM-T Easy ở vị trí mở vịng T/T nhờ T4-DNA ligase. Plasmid sau đó biến nạp vào vi khuẩn E.coli TOP10 và sàng lọc trên mơi trường thích hợp. Sau một đêm ni cấy xuất hiện 2 loại khuẩn lạc màu trắng và màu xanh. Sáu khuẩn lạc màu trắng được kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA chèn trong vector nhân dòng bằng PCR với cặp mồi T7-SP6. Kích thước mong đợi của sản phẩm PCR ở các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp là 1144 bp và 1346 bp tương ứng cho 2 gen ANK1, ANK2.
Đối với các khuẩn lạc tự đóng vịng, kích thước sản phẩm PCR là 176 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 16A, B) cho thấy 2 băng DNA tương ứng với 2 gen
ANK1, ANK2 gần đúng với kích thước mong đợi, như vậy các khuẩn lạc kiểm tra là
dương tính. Kết quả kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI thu được 2 băng DNA, một băng có kích thước khoảng 3.0 kb là kích thước nguyên bản của vector pGEM-T Easy, băng thứ hai là đoạn DNA chứa trình tự ANK1, ANK2 (Hình 16C,
D). Các kết quả thu được cho phép khẳng định đã đưa được đoạn DNA với kích
Hình 16. Kiểm tra sự có mặt của đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 trong vector pGEM-T tái tổ hợp bằng PCR và cắt enzyme giới hạn.
A, B: sản phẩm PCR khuẩn lạc với mồi T7-SP6. C, D: sản phẩm cắt plasmid với enzyme EcoRI. Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
Kết quả giải trình tự các plasmid thu được bốn/sáu dòng mang đầy đủ, và chính xác trình tự mã hóa gen ANK1 và các trình tự attB1-attB2 (Hình 17B). Tuy
nhiên khi phân tích trình tự của 6 cấu trúc pGEM-T_CDS_ANK2 đều nhận thấy sự thiếu hụt 186 bp (toàn bộ vùng exon 2) so với trình tự tham chiếu (Hình 17C). Trình tự tham chiếu của ANK2 cơng bố trên các cơ sở dữ liệu là trình tự được dự
đốn dựa trên các phân tích tin sinh của trình tự nucleotide trên DNA, ANK2 chưa
từng được nghiên cứu trước đây, do đó, có thể vùng 186 bp (exon 2 trong trình tự tham chiếu) trên thực tế có thể là vùng khơng mã hóa (intron) hoặc đây là một dạng mRNA của ANK2. Để kiểm tra giả thiết này, đoạn trình tự mã hóa gen ANK2 đã
được phân lập lại từ mẫu bơng non của giống lúa mơ hình Kitaake và giải trình tự, kết quả thu được trình tự trùng khớp với trình tự của đoạn mã hóa gen ANK2 được phân lập từ giống Nipponbare, đều thiếu 186 pb so với trình tự tham chiếu được công bố trên các trang dữ liệu.
Phân tích cấu trúc protein từ trình tự thu được cho thấy gen ANK2 mã hóa
protein với 4 motif ankyrin, 3 motif TPR (trong khi trình tự tham chiếu tạo ra protein có 5 motif ankyrin, 3 motif TPR) tuy nhiên vẫn có thể tạo ra một vị trí liên kết với một phối tử sinh học khác.
Hình 17. Kết quả phân tích trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 trong vector pGEM-T Easy tái tổ hợp.