Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) Mục đích Sử dụng
Actin-F CATTCCAGCAGATGTGGATTG Sử dụng cho phản ứng PCR kiểm
tra cDNA, phản ứng qPCR đánh giá biểu hiện gen
Actin-R TCTTGGCTTAGCATTCTTGG
ANK1_F1 CCACGGGTTC CTCGTCTCTT CC
Ba cặp mồi dùng trong các phản ứng PCR lồng nhằm phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1
ANK1_R1 GACAGGTAATTCAGGCAGCACGA G ANK1_F2 CATGGCGCCGCCTCACGC ANK1_R2 TTTATGCCCTACTTCCTTCTAACTT CAGATC ANK1_F2_attB1 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctCATGG CGCCGCCTCACGC ANK1_R2_attB2 ggggaccactttgtacaagaaagctgggttTTTATG CCCTACTTCCTTCTAACTTCAGATC ANK2_F1 CGACTAACTCGATCTGCTCCTCGC Ba cặp mồi dùng trong các phản ứng PCR lồng nhằm phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK2
ANK2_R1 CCGTGATGTTCAACAGTCACCACC
ANK2_F2 AATGGTGGAGAAGTTGCTCTTCG
Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) Mục đích Sử dụng
ANK2_F2-attB1 ggggacaagtttgtacaaaaaagcaggctAATGG
TGGAGAAGTTGCTCTTCG
ANK2_R2-attB2 ggggaccactttgtacaagaaagctgggttTTCAC
CTAGCCTCTGTGCTTGC
T7 TAATACGACTCACTATAGGG Kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA
chèn trong vector pGEM-T Easy tái tổ hợp và giải trình tự vector
SP6 ATTTAGGTGACACTATAG
pUBI GGATGATGGCATATGCAGCAG
Kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA chèn trong vector PC5300.OE tái tổ hợp và giải trình tự vector pCaMV35S TGACAGATAGCTGGGCAATG ANK1-S1 GTGACCTCCGCCTCTTCA ANK1-AS1 TGCCCTACTTCCTTCTAACTTC ANK2-S2 ACAGACGGAAAGATGTGGAGA ANK2-AS2 AAATCAGTGGCGTAGCACCT
HPT-OE-F TTCAGCTTCGATGTAGGAGG Kiểm tra vector, cây chuyển gen
mang cấu trúc PC5300.OE-ANK
HPT-OE-R AGAAGAAGATGTTGGCGACC
SPS-F TTGCGCCTGAACGGATAT
Đánh giá số bản sao T-DNA trong cây chuyển gen
SPS-R CGGTTGATCTTTTCGGGATG
CDS-ANK1-F CGCCAACGAGTCAGGTGCTA Sử dụng cho phản ứng qPCR đánh
giá mức độ biểu hiện của gen
ANK1 trong các dòng lúa chuyển
gen
CDS-ANK1-R TGGCGTCCCACAGTCAGAAG
CDS-ANK2-F AACCGTGGCACACCACTTCA Sử dụng cho phản ứng qPCR đánh
giá mức độ biểu hiện của gen
ANK2 trong các dòng lúa chuyển
gen
CDS-ANK2-R GAGCCACCCTTTGCAGCAGT
pU3-F GACCATGATTACGCCAAGCTTAAG
GAATCTTTAAACATACG Kiểm tra sự có mặt của gRNA
trong vector, cây chuyển gen
gRNA-R GGACCTGCAGGCATGCACGCGCTA
Tên mồi Trình tự (5’ – 3’) Mục đích Sử dụng
pUBI-F GCTTGTGCGTTTCGATTTGA Kiểm tra sự có mặt của protein
Cas9 trong vector, cây chuyển gen mang
Cas9-R CCGCTCGTGCTTCTTATCCT
HPT-F GCTCCAGTCAATGACCGCTG Kiểm tra sự có mặt của gen kháng
hygromycin trong vector, cây chuyển gen
HPT-R CTCGGAGGGCGAAGAATCTC
ANK1_Ex4_F1 CACGTTATCAACAAACCTCCTATC Kiểm tra đột biến trong các dòng
lúa chuyển gen CRISPR/Cas9- ANK1
ANK1_Ex4_R1 CTGACTATAGAACACAGACTTTCG
ANK2_Ex4_F2 CAGTTATCACGGTTATCATGTGC Kiểm tra đột biến trong các dòng
lúa chuyển gen CRISPR/Cas9- ANK2
ANK2_Ex4_R2 CGTAATCTTCATGCTTGGAAC
2.2.3. Tách chiết DNA, RNA, tổng hợp cDNA
Tách chiết DNA
DNA tổng số được tách chiết từ lá lúa. Tiến hành thu 2cm mẫu lá khi cây có 4-5 lá thật (khoảng 20-25 ngày tuổi), làm lạnh trong nito lỏng. DNA được tách chiết bằng phương pháp sử dụng CTAB của Doyle có cải tiến [9]. Trong đó, xác tế bào và protein được loại bỏ bằng CH3COOK và chloroform, DNA được thu lại dưới dạng kết tủa với isopropanol, và rửa với ethanol 70%. DNA được bảo quản ở -200C.
Thu mẫu bông non, tách chiết RNA, tổng hợp cDNA
Cây Nipponbare được gieo trồng với chu kỳ chiếu sáng 14 giờ/ngày tại nhà kính viện Di truyền nơng nghiệp. Giai đoạn ra hoa sẽ được thúc đẩy bằng cách điều chỉnh thời gian chiếu sáng 10 giờ/ngày. Thu mẫu bông non ở 2 giai đoạn: Giai đoạn sớm (giai đoạn phát sinh trục bông và phân chia nhánh) và giai đoạn muộn (giai đoạn phát sinh hoa). Mẫu bông non sau khi thu lập tức được làm lạnh trong nito lỏng và bảo quản ở -800C.
RNA tổng số được tách chiết từ mẫu bông non, bằng Kit ”RNeasy Plant Mini Kit” (Qiagen), các mẫu RNA sau đó được xử lý gDNA bằng DNaseI (Thermo Scientific) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
cDNA được tổng hợp từ 1µg RNA tổng số (đã xử lý gDNA) bằng kit SuperScript® III Reverse Transcriptase (Invitrogen) theo hướng dẫn của nhà sản xuất.
Kiểm tra DNA, RNA
Nồng độ và độ tinh sạch của DNA/RNA được kiểm tra ở bước sóng OD260. Mẫu sạch, không bị nhiễm protein khi tỷ số 1,8< OD260/280 < 2,0 và không bị nhiễm các tạp chất khác khi tỷ số 1,8< OD230/260 < 2,0.
Kiểm tra tính tồn vẹn của DNA/RNA: Chất lượng hay độ bảo toàn nguyên vẹn của DNA/RNA (không bị đứt gãy) được kiểm tra bằng phương pháp điện di.
2.2.4. Phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2
Trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 được phân lập từ cDNA tổng số bằng
phản ứng PCR lồng. Phản ứng PCR1 sử dụng cặp mồi ANK1_F1, ANK1_R1 đối với gen ANK1, ANK2_F1, ANK2_R1 đối với gen ANK2. Mồi được thiết kế trong vùng 5’UTR và 3’UTR của mỗi gen nhằm tăng tính đặc hiệu. Phản ứng PCR2 được thực hiện từ khuôn là sản phẩm của PCR1 với cặp mồi ANK1_F2, ANK1_R2 và ANK2_F2, ANK2_R2 nhằm khuếch đại tồn bộ đoạn trình tự mã hóa từ mã mở đầu cho đến mã kết thúc của mỗi gen tương ứng. Phản ứng PCR3 được thực hiện từ khuôn là sản phẩm của PCR2, sử dụng cặp mồi ANK1_F2-attB1, ANK1_R2-attB2 và ANK2_F2-attB1, ANK2_R2-attB2 nhằm gắn thêm trình tự tái tổ hợp attB1 và attB2 vào trình tự mã hóa của gen ANK1, ANK2 phục vụ đưa đoạn trình tự mã hóa của gen
ANK1, ANK2 vào vector siêu biểu hiện PC5300.OE (Các mồi sử dụng được trình bày
trong Bảng 1).
Các phản ứng PCR lồng sử dụng kit “Phusion II High Fidelity DNA polymerase Kit” (F-549S/L, Thermo Scientific, USA) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Vị trí các cặp mồi thiết kế được thể hiện trên hình 9.
Hình 9. Sơ đồ vị trí gắn mồi dùng phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1 (A), ANK2 (B)
2.2.5. Đưa đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector pGEM-T Easy
Các sản phẩm PCR khuếch đại trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 là các
mảnh DNA có đầu bằng, do đó một phản ứng gắn Adenin vào hai đầu sản phẩm tinh sạch của phản ứng PCR3 (attB1-ANK-attB2) được thực hiện nhằm đưa sản phẩm PCR3 vào vector pGEM-T Easy ở vị trí mở vịng T-T. Phản ứng gắn adenin được thực hiện bởi Dream Taq DNA polymerase (#FP0702 Fermentas) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Sản phẩm của phản ứng được gắn vào vector pGEM-T Easy nhờ T4 DNA ligase (A1360, Promega, USA). Plasmid được biến nạp vào E.coli
TOP10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Vi khuẩn được sàng lọc trên môi trường LB bổ sung Ampicillin 100 mg/l, IPTG 0,1 M , X-Gal 50 mg/l. Các khuẩn lạc màu trắng sẽ được chọn và nuôi cấy tăng sinh riêng rẽ trong 10ml môi trường LB lỏng bổ sung kháng sinh Ampicillin 100 mg/l ở nhiệt độ 370C và lắc 200 vịng/phút qua đêm. Sau đó DNA plasmid sẽ được tách chiết bằng kit GeneJET Plasmid Miniprep Kit (Thermo Scientific). Sự có mặt của đoạn trình tự mã hóa gen trong vector được kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi T7, SP6 và cắt bằng cắt giới hạn EcoRI, sau đó được gửi đi giải trình tự. Kết quả trình tự thu được được so sánh với trình tự tham chiếu của gen trên cơ sở dữ liệu NCBI.
2.2.6. Ghép nối đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector PC5300.OE PC5300.OE
Đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 được đưa từ vector pGEM-T Easy
sang vector biểu hiện PC5300.OE bằng kỹ thuật Gateway (Hình 10). Vector pGEM-T Easy được cắt mở vòng bằng enzyme SalI, sau đó được tinh sạch bằng
30% PEG 8000/30 mM MgCl2. 3µl (150ng) vector pGEM-T Easy đã mở vịng và 1 µl (150 ng) vector PC5300.OE được sử dụng cho phản ứng tái tổ hợp bằng kít Gateway BP Clonase II Enzyme Mix (INVITROGEN) theo hướng dẫn của nhà sản xuất. 2 µl của hỗn hợp sau phản ứng được biến nạp vào khuẩn E.coli TOP 10 bằng phương pháp sốc nhiệt. Các khuẩn lạc được chọn lọc trên đĩa môi trường LB chứa Kanamycin 50 mg/l. Các dòng tế bào mọc trên đĩa được sàng lọc bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc với cặp mồi pUbi, ANK1_R2 đối với gen ANK1 và pUbi ,
ANK2_R2 đối với gen ANK2.
Hình 10. Phản ứng tái tổ hợp giữa vector pGEM-T_CDS_ANK và vector PC5300.OE
Các plasmid tách chiết từ các dòng khuẩn lạc dương tính được kiểm tra bằng enzyme cắt giới hạn EcoRI và giải trình tự với 2 cặp mồi được trình bày trong bảng 1, vị trí các cặp mồi được thể hiện trên hình 11.
2.2.7. Thiết kế cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) bất hoạt gen ANK1, ANK2 ANK2
*Phương pháp thiết kế gRNA
Các trình tự gRNA spacer được thiết kế bằng phần mềm CRISPRdirect tại địa chỉ (http://crispr.dbcls.jp/). Để xem xét khả năng cắt không đặc hiệu (off-target) của gRNA spacer đối với hệ gen của giống lúa Nipponbare, thông số “Specificity check” được lựa chọn là: Rice (Oryza sativa ssp. japonica) genome, Os- Nipponbare-Reference-IRGSP-1.0 (Oct, 2011). Các trình tự gRNA spacer có chỉ số cắt không đặc hiệu thấp nhất được lựa chọn (Bảng 2).