CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.5. Chọn lọc các dòng chuyển gen đột biến gen ANK1, ANK2 bằng công nghệ
3.5.3. Chọn lọc các dòng T1 đột biến đồng hợp
Các dòng chuyển gen thế hệ T0 mang đột biến hầu hết đều tồn tại ở trạng thái dị hợp tử (trừ dòng T0.Cas9-ANK1_2.32), các dịng này tiếp tục được phân tích
ở thế hệ T1 bằng kỹ thuật PCR và giải trình tự như ở thế hệ T0 để tìm kiếm các dịng đột biến đồng hợp tử.
Đối với gen ANK1, thu được bốn dòng T1 đột biến đồng hợp tử (ank1-1.8.4, ank1-2.32.12, ank1-5.1.3, ank1-5.1.8) mất từ 1 bp đến 8 bp (Hình 27A). Phân tích cấu
trúc protein của các thể đột biến cho thấy 3 dòng ank1-5.1.3, ank1-5.1.8, ank1-2.32.12 xuất hiện mã kết thúc sớm ở sau axit amin thứ 127, 126, 125 (Hình 27B). Protein mới của cả 3 thể đột biến đều mất 4 motif ankyrin cuối cùng so với protein của thể khơng đột biến, chỉ cịn lại 2 motif ankyrin đầu tiên trong cấu trúc và do đó mất vị trí liên kết
với các phân tử peptide khác. Đối với dịng ank1-1.8.4 (mất 3 bp trong trình tự DNA, mất axit amin thứ 125 trong trình tự protein) protein mới tạo ra vẫn bảo tồn 6 motif ankyrin như protein không bị đột biến (Hình 27C).
Hình 27. Sự thay đổi trong trình tự DNA (A), trình tự protein (B) và cấu trúc protein (C) của các dòng đột biến T1.Cas9-ANK1
Đối với gen ANK2, kết quả phân tích chỉ ra có ba dòng đột biến đồng hợp tử , mất 50-70 bp trong trình tự DNA. Dịng đột biến ank2-2.1.8 mất 60 bp trong
DNA, loại bỏ 20 axit amin trong trình tự protien, tuy nhiên số lượng các motif ANK và TPR trong protein không bị thay đổi so với protein khơng đột biến. Dịng ank2-
5.10.1 mất 59 bp, tạo mã kết thúc sớm trong chuỗi mã hóa protein. Protein đột biến
mất 2 motif ankyrin sau cùng và 3 motif TPR, khơng thể tạo ra vị trí bám với các peptide khác. Dịng đột biến ank2-5.10.6 mất 78bp trong trình tự mã hóa, dẫn đến
thiếu hụt 26 axit amin trong trình tự chuỗi polypeptide, làm mất đi motif ankyin số 4. Sự vắng mặt của motif ankyrin số 4 làm tăng khoảng cách giữa motif số 3 và số 5, do đó có khả năng cấu trúc khơng gian của phân tử protein này khơng thể hình thành vị trí liên kết với các phân tử sinh học khác (Hình 28).
Hình 28. Sự thay đổi trong trình tự DNA(A), trình tự protein (B) và cấu trúc protein của các dòng đột biến T1.Cas9-ANK2
Đối với hai dòng chuyển gen mang cấu trúc có khả năng gây đột biến đồng thời cả hai gen ANK1, ANK2 (22.61.1 và 60.21.1), kết quả phân tích trình tự của cả
hai gen cho thấy dịng 60.21.1 khơng có đột biến ở cả hai gen ANK1, ANK2. Trong khi đó dịng ank12-22.61.1 có đột biến đồng hợp ở cả hai gen, mất 4 bp ở exon 4 của gen ANK1 và mất 20 bp ở exon 4 của gen ANK2. Cả hai đột biến này tạo ra hai protein xuất hiện mã kết thúc sớm. Protein ANK1 chỉ còn 2 motif ankyrin đầu tiên, protein ANK2 mất 2 motif ankyrin cuối cùng và cả 3 motif TPR. Cả hai protein đều mất vị trí liên kết với các phân tử sinh học khác (Hình 29).
Các dòng đột biến tạo protein khơng hồn chỉnh được sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
Hình 29. Sự thay đổi trong trình tự DNA, trình tự protein và cấu trúc protein của dòng đột biến T1.Cas9-ANK(1+2)
KẾT LUẬN
Đề tài đã thu được các kết quả như sau:
1. Đã phân lập, nhân dịng và giải trình tự đẩy đủ 2 gen ANK1, ANK2
2. Thiết kế được cấu trúc vector tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 dưới sự kiểm soát của promoter Ubiquitin và chuyển thành công vào giống lúa Kitaake.
3. Thiết kế thành công các cấu trúc Polycistronic tRNA-gRNA (PTG) để bất hoạt riêng rẽ hoặc đồng thời hai gen ANK1, ANK2 bằng công nghệ CRISPR/Cas9
và chuyển thành công vào giống lúa Kitaake.
4. Chọn lọc được ba dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1 đồng hợp tử, mang một bảo sao T-DNA, trong đó biểu hiện của gen ANK1 tăng 6-5400 lần so với các dòng đối chứng. Tuy nhiên chỉ chọn được 1 dòng tăng cường biểu hiện gen ANK2 với mức độ biểu hiện tăng hơn 2 lần so với đối chứng.
5. Chọn lọc được 4 dòng đột biến gen ANK1 đồng hợp, ba trong số đó tạo
protein khơng hồn chỉnh và mất vị trí liên kết với phối tử. Đồng thời thu được 3 dòng đột biến gen ANK2 đồng hợp, trong đó 2 dịng tạo ra protein khơng hoàn
chỉnh và mất vị trí tương tác với protein. Chỉ chọn được duy nhất 1 dòng đồng hợp đột biến cả 2 gen ANK1, ANK2, cả 2 protein đột biến đều mất vị trí liên kết với
KIẾN NGHỊ
Từ các kết quả thu được của đề tài, chúng tôi sẽ tiến hành đánh giá kiểu hình cấu trúc bơng của các dịng chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 và
các dòng đột biến để làm sáng tỏ vai trò của gen ANK1, ANK2 liên quan đến cấu
trúc bơng, đặc biệt là 2 tính trạng số gié thứ cấp/bơng và số hoa/bơng.
Bên cạnh đó, biểu hiện của gen ANK1, ANK2 trong các mô phân sinh cấu
trúc bông sẽ được nghiên cứu bằng phương pháp lai tại chỗ (in situ hybridization) ở các dòng chuyển gen và dòng đối chứng. Tương tác của protein ANK1, ANK2 với các phối tử được dự đốn trên cơ sở phân tích tin sinh cũng sẽ được kiểm định bằng phương pháp lai miễn dịch để từ đó hiểu sâu hơn về các cơ chế hoạt động của protein ANK1, ANK2.
Phần lớn các SNPs, Indels được tìm thấy trong vùng promoter của 2 gen
ANK1, ANK2 nên các nghiên cứu phân tích chức năng promoter của 2 gen cũng sẽ
TÀI LIỆU THAM KHẢO
1. Begum, Hasina, Jennifer E. Spindel, Antonio Lalusin, Teresita Borromeo, Glenn Gregorio, Jose Hernandez, Parminder Virk, Bertrand Collard, Susan R. McCouch. 2015. “Genome-Wide Association Mapping for Yield DNA Other Agronomic Traits in an Elite Breeding Population of Tropical Rice (Oryza Sativa)”. PLOS One 10 (3).
2. Linda Breeden, Kim Nasmyth. 1987. “Similarity between Cell-Cycle Genes of Budding Yeast DNA Fission Yeast DNA the Notch Gene of Drosophila”.
Nature 329 (6140).
3. Butt, Haroon, Muhammad Jamil, Jian You Wang, Salim Al-Babili, Magdy Mahfouz. 2018. “Engineering plant architecture via CRISPR/Cas9-mediated alteration of strigolactone biosynthesis”. BMC Plant Biology 18.
4. Chen, Yingnan, Xiaorong Fan, Wenjing Song, Yali Zhang, Guohua Xu. 2012. “Over-Expression of OsPIN2 Leads to Increased Tiller Numbers, Angle DNA Shorter Plant Height through Suppression of OsLAZY1”. Plant Biotechnology Journal 10 (2).
5. Chinenov, Yurii, Tonya Schmidt, Xiu-Ying Yang, Mark E. Martin. 1998. “Identification of Redox-Sensitive Cysteines in GA-Binding Protein-α That Regulate DNA Binding DNA Heterodimerization”. Journal of Biological Chemistry 273 (11).
6. Choi, Man Soo, Min Chul Kim, Jae Hyuk Yoo, Byeong Cheol Moon, Sung Cheol Koo, Byung Ouk Park, Ju Huck Lee. 2005. “Isolation of a Calmodulin-Binding Transcription Factor from Rice (Oryza Sativa L.)”. The Journal of Biological Chemistry 280 (49).
7. Crowell, Samuel, Pavel Korniliev, Alexandre Falcão, Abdelbagi Ismail, Glenn Gregorio, Jason Mezey, Susan McCouch. 2016. “Genome-Wide Association DNA High-Resolution Phenotyping Link Oryza Sativa Panicle Traits to Numerous Trait-Specific QTL Clusters”. Nature Communications 7 (1).
8. Dong, Xinnian. 2004. “The Role of Membrane-Bound Ankyrin-Repeat Protein ACD6 in Programmed Cell Death DNA Plant Defense”. Science’s STKE: Signal Transduction Knowledge Environment 2004 (221).
9. Doyle. 1987. “A rapid DNA isolation procedure from small quantities of fresh leaf tissue”.
10. Elmendorf, Heidi G., Sally C. Rohrer, Rasha S. Khoury, Rachel E. Bouttenot, Theodore E. Nash. 2005. “Examination of a Novel Head-Stalk Protein Family in Giardia Lamblia Characterised by the Pairing of Ankyrin Repeats DNA Coiled-Coil Domains”. International Journal for Parasitology 35 (9).
11. Garcion, Christophe, Jocelyne Guilleminot, Thomas Kroj, Franỗois Parcy, Jộrụme Giraudat, Martine Devic. 2007. “AKRP DNA EMB506 are two ankyrin repeat proteins essential for plastid differentiation DNA plant development in Arabidopsis”. The Plant journal: for cell DNA molecular biology 48.
12. Hashemi, Seyed M., Thomas J. Hund, Peter J. Mohler. 2009. “Cardiac ankyrins in health DNA disease”. Journal of molecular DNA cellular cardiology 47 (2).
13. He, Qin, Lin Yang, Wei Hu, Jia Zhang, Yongzhong Xing. 2018. “Overexpression of an Auxin Receptor OsAFB6 Significantly Enhanced Grain Yield by Increasing Cytokinin DNA Decreasing Auxin Concentrations in Rice Panicle”. Scientific Reports 8 (1).
14. Huang, Jian, Feng Chen, Cecilia Del Casino, Antonella Autino, Mouhua Shen, Shuai Yuan, Jia Peng. 2006. “An Ankyrin Repeat-Containing Protein, characterized as a Ubiquitin Ligase, Is Closely Associated with Membrane- Enclosed Organelles DNA Required for Pollen Germination DNA Pollen Tube Growth in Lily”. Plant Physiology 140 (4).
15. Huang, Jianyan, Xiaobo Zhao, Huihui Yu, Yidan Ouyang, Lei Wang, Qifa Zhang. 2009. “The Ankyrin Repeat Gene Family in Rice: Genome-Wide
Identification, Classification DNA Expression Profiling”. Plant Molecular Biology 71 (3).
16. Huang, Xianzhong, Qian Qian, Zhengbin Liu, Hongying Sun, Shuyuan He, Da Luo, Guangmin Xia, Chengcai Chu, Jiayang Li, Xiangdong Fu. 2009. “Natural Variation at the DEP1 Locus Enhances Grain Yield in Rice”.
Nature Genetics 41 (4).
17. Huang, Xuehui, Xinghua Wei, Tao Sang, Qiang Zhao, Qi Feng, Yan Zhao, Canyang Li. 2010. “Genome-Wide Association Studies of 14 Agronomic Traits in Rice LDNAraces”. Nature Genetics 42 (11).
18. Ikeda-Kawakatsu, Kyoko, Masahiko Maekawa, Takeshi Izawa, Jun-Ichi Itoh, Yasuo Nagato. 2012. “ABERRANT PANICLE ORGANIZATION 2/RFL, the Rice Ortholog of Arabidopsis LEAFY, Suppresses the Transition from Inflorescence Meristem to Floral Meristem through Interaction with APO1”.
The Plant Journal: For Cell DNA Molecular Biology 69 (1).
19. Jiang, Yingnan, Xiuhua Chen, Xiaodong Ding, Yongsheng Wang, Qiang Chen, Wen-Yuan Song. 2012. “The XA21 binding protein XB25 is required for maintaining XA21-mediated Disease Resistance.” The Plant journal: for cell DNA molecular biology 73.
20. Khanday, Imtiyaz, Shri Ram Yadav, Usha Vijayraghavan. 2013. “Rice LHS1/OsMADS1 Controls Floret Meristem Specification by Coordinated Regulation of Transcription Factors DNA Hormone Signaling Pathways”.
Plant Physiology 161 (4).
21. Komatsu, M., M. Maekawa, K. Shimamoto, J. Kyozuka. 2001. “The LAX1 DNA FRIZZY PANICLE 2 Genes Determine the Inflorescence Architecture of Rice by Controlling Rachis-Branch DNA Spikelet Development”.
Developmental Biology 231 (2).
22. Kumagai, Hirotaka, Tsuneo Hakoyama, Yosuke Umehara, Shusei Sato, Takakazu Kaneko, Satoshi Tabata, Hiroshi Kouchi. 2007. “A Novel Ankyrin-Repeat Membrane Protein, IGN1, Is Required for Persistence of
Nitrogen-Fixing Symbiosis in Root Nodules of Lotus Japonicus”. Plant Physiology 143 (3).
23. Kurakawa, Takashi, Nanae Ueda, Masahiko Maekawa, Kaoru Kobayashi, Mikiko Kojima, Yasuo Nagato, Hitoshi Sakakibara, Junko Kyozuka. 2007. “Direct Control of Shoot Meristem Activity by a Cytokinin-Activating Enzyme”. Nature 445 (7128).
24. Kyozuka, Junko, Hiroki Tokunaga, Akiko Yoshida. 2014. “Control of Grass Inflorescence Form by the Fine-Tuning of Meristem Phase Change”. Current
Opinion in Plant Biology 17.
25. Lee, Sung Chul, Wen-Zhi Lan, Beom-Gi Kim, Legong Li, Yong Hwa Cheong, Girdhar K. PDNAey, Guihua Lu, Bob B. Buchanan, Sheng Luan. 2007. “A Protein Phosphorylation/Dephosphorylation Network Regulates a Plant Potassium Channel”. Proceedings of the National Academy of Sciences
of the United States of America 104 (40).
26. Li, Meiru, Xiaoxia Li, Zejiao Zhou, Pingzhi Wu, Maichun Fang, Xiaoping Pan, Qiupeng Lin, Wanbin Luo, Guojiang Wu, Hongqing Li. 2016. “Reassessment of the Four Yield-Related Genes Gn1a, DEP1, GS3, DNA IPA1 in Rice Using a CRISPR/Cas9 System”. Frontiers in Plant Science 7:
377.
27. Ma, Xiaosong, Fangjun Feng, Yu Zhang, Ibrahim Eid Elesawi, Kai Xu, Tianfei Li, Hanwei Mei. 2019. “A Novel Rice Grain Size Gene OsSNB Was Identified by Genome-Wide Association Study in Natural Population”.
PLOS Genetics 15 (5)
28. Ma, Xuefeng, Zhijun Cheng, Ruizhen Qin, Yang Qiu, Yueqin Heng, Hui Yang, Yulong Ren. 2013. “OsARG Encodes an Arginase That Plays Critical Roles in Panicle Development DNA Grain Production in Rice”. The Plant Journal: For Cell DNA Molecular Biology 73 (2)
29. McCouch, Susan R., Mark H. Wright, Chih-Wei Tung, Lyza G. Maron, Kenneth L. McNally, Melissa Fitzgerald, Namrata Singh. 2016. “Open
Access Resources for Genome-Wide Association Mapping in Rice”. Nature Communications 7 (1).
30. Miles, Melissa, Michelle Janket, Elizabeth Wheeler, Ansuman Chattopadhyay, Biswanath Majumder, Jeremy Dericco, Elizabeth Schafer, Velpandi Ayyavoo. 2005. “Molecular DNA functional characterization of a novel splice variant of ANKHD1 that lacks the KH domain DNA its role in cell survival DNA apoptosis”. The FEBS journal 272.
31. Mosavi, Leila K., Daniel L. Minor, Zheng-Yu Peng. 2002. “Consensus- Derived Structural Determinants of the Ankyrin Repeat Motif”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 99 (25)
32. Mou, Shaoliang, Zhiqin Liu, Deyi Guan, Ailian Qiu, Yan Lai, Shuilin He. 2013. “Functional Analysis DNA Expressional Characterization of Rice Ankyrin Repeat-Containing Protein, OsPIANK1, in Basal Defense against Magnaporthe Oryzae Attack”. PLOS One 8 (3).
33. Nakagawa, Mayu, Ko Shimamoto, Junko Kyozuka. 2002. “Overexpression of RCN1 DNA RCN2, Rice TERMINAL FLOWER 1/CENTRORADIALIS Homologs, Confers Delay of Phase Transition DNA Altered Panicle Morphology in Rice”. The Plant Journal: For Cell DNA Molecular Biology 29 (6).
34. Nodzon, Lisa A., Wei-Hui Xu, Yongsheng Wang, Li-Ya Pi, Pranjib K. Chakrabarty, Wen-Yuan Song. 2004. “The Ubiquitin Ligase XBAT32 Regulates Lateral Root Development in Arabidopsis”. The Plant Journal: For Cell DNA Molecular Biology 40 (6).
35. Park, Chang-Jin, Tong Wei, Rita Sharma, Pamela C. Ronald. 2017. “Overexpression of Rice Auxilin-Like Protein, XB21, Induces Necrotic Lesions, up-regulates Endocytosis-Related Genes, DNA Confers Enhanced Resistance to Xanthomonas Oryzae Pv. Oryzae”. Rice (New York, N.Y.) 10
(1).
36. Pfaffl. M. W. 2001. “A New Mathematical Model for Relative Quantification in Real-Time RT-PCR”. Nucleic Acids Research 29 (9).
37. Sedgwick, S. G., S. J. Smerdon. 1999. “The Ankyrin Repeat: A Diversity of Interactions on a Common Structural Framework”. Trends in Biochemical Sciences 24 (8).
38. Shan, Qiwei, Yanpeng Wang, Jun Li, Yi Zhang, Kunling Chen, Zhen Liang, Kang Zhang. 2013. “Targeted Genome Modification of Crop Plants Using a CRISPR-Cas System”. Nature Biotechnology 31 (8).
39. Si, Lizhen, Jiaying Chen, Xuehui Huang, Hao Gong, Jianghong Luo, Qingqing Hou, Taoying Zhou. 2016. “OsSPL13 Controls Grain Size in Cultivated Rice”. Nature Genetics 48 (4).
40. Ta. K. N, H. Adam, Y. M. Staedler, J. Schönenberger, T. Harrop, J. Tregear, N. V. Do, P. Gantet, A. Ghesquière, S. Jouannic. 2017. “Differences in Meristem Size DNA Expression of Branching Genes Are Associated with Variation in Panicle Phenotype in Wild DNA Domesticated African Rice”.
EvoDevo 8: 2.
41. Ta. K. N, Ngan Giang Khong, Thi Loan Ha, Dieu Thu Nguyen, Duc Chung Mai, Thi Giang Hoang, Thi Phuong Nhung Phung. 2018. “A Genome-Wide Association Study Using a Vietnamese LDNArace Panel of Rice (Oryza Sativa) Reveals New QTLs Controlling Panicle Morphological Traits”. BMC
Plant Biology 18 (1).
42. Xie, Kabin, Bastian Minkenberg, Yinong Yang. 2015. “Boosting CRISPR/Cas9 Multiplex Editing Capability with the Endogenous TRNA- Processing System”. Proceedings of the National Academy of Sciences of the
United States of America 112 (11).
43. Xie, Kabin, Yinong Yang. 2013. “RNA-Guided Genome Editing in Plants Using a CRISPR-Cas System”. Molecular Plant 6 (6).
44. Ya-fang, ZHANG, MA Yu-yin, CHEN Zong-xiang, ZOU Jie, CHEN Tian- xiao, LI Qian-qian, PAN Xue-biao, ZUO Shi-min. 2015. “Genome-Wide Association Studies Reveal New Genetic Targets for Five Panicle Traits of International Rice Varieties”. Rice Science 22 (5).
45. Yoshida, Akiko, Yoshihiro Ohmori, Hidemi Kitano, Fumio Taguchi- Shiobara, Hiro-Yuki Hirano. 2012. “Aberrant Spikelet DNA Panicle1, encoding a TOPLESS-Related Transcriptional Co-Repressor, Is Involved in the Regulation of Meristem Fate in Rice”. The Plant Journal: For Cell DNA
Molecular Biology 70 (2).
46. Yoshida, Hitoshi, Yasuo Nagato. 2011. “Flower Development in Rice”.
Journal of Experimental Botany 62 (14).
47. Zeng, Zhengming, Fangjie Xiong, Xiaohong Yu, Xiaoping Gong, Juntao Luo, Yudong Jiang, Haochi Kuang, Bijun Gao, Xiangli Niu, Yongsheng Liu. 2016. “Overexpression of a Glyoxalase Gene, OsGly I, Improves Abiotic Stress Tolerance DNA Grain Yield in Rice (Oryza Sativa L.)”. Plant Physiology DNA Biochemistry: PPB 109.
48. Zhang, H., D. C. Scheirer, W. H. Fowle, H. M. Goodman. 1992. “Expression of Antisense or Sense RNA of an Ankyrin Repeat-Containing Gene Blocks Chloroplast Differentiation in Arabidopsis”. The Plant Cell 4 (12).
49. Zhang, Hui, Jinshan Zhang, Pengliang Wei, Botao Zhang, Feng Gou, Zhengyan Feng, Yanfei Mao. 2014. “The CRISPR/Cas9 System Produces Specific DNA Homozygous Targeted Gene Editing in Rice in One Generation”. Plant Biotechnology Journal 12 (6).
50. Zhang, Yuwen, Yan Liu, Jie Zhang, Guoying Wang, Jianhua Wang, Yunjun Liu. 2015. “Assessment of transgene copy number DNA zygosity of transgenic maize overexpressing Cry1Ie gene with SYBR® Green qRT- PCR”. In Vitro Cellular & Developmental Biology - Plant 51.