CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.4. Chọn lọc các dòng chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2
3.4.1. Sàng lọc các dòng T0 chuyển gen, đánh giá hiệu quả chuyển gen
35 dòng tái sinh của mỗi cấu trúc PC5300.OE-ANK1, PC5300.OE-ANK2 và PC5300.OE.Ø được phân tích để sàng lọc các dịng chuyển gen dương tính. Các cây được thu lá, tách chiết DNA để thực hiện phản ứng PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen HPT (HPT-OE-F và HPT-OE-R, bảng 1). Kích thước mong đợi của đoạn
khuếch đại là 999 bp. Kết quả thu được 13 dịng T0.OE-ANK1 dương tính (Hình
22A), hiệu quả chuyển gen đạt 37%, 12 dịng T0.OE-ANK2 dương tính (Hình 22B), đạt hiệu quả chuyển gen 34% và 5 dịng T0.OE.Ø dương tính, hiệu quả
Hình 22. Kết quả sàng lọc cây chuyển gen T0 mang cấu trúc tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2 bằng PCR.
A: các dòng T0.OE-ANK1, B: các dòng T0.OE-ANK2. (+): vector tăng cường biểu hiện ANK1 (PC5300.OC-ANK1), vector tăng cường biểu hiện ANK2 (PC5300.OC-ANK2). (- )Kitaake không chuyển gen. Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
3.4.2. Chọn lọc các dòng T1 đồng hợp tử mang một bản sao T-DNA
30 hạt của mỗi dòng chuyển gen T0 được cho nảy mầm trong môi trường MS/2 chứa 50 mg/L Hygromycin. Kết quả thu được 4 dòng tăng cường biểu hiện gen ANK1, 3 dòng tăng cường biểu hiện gen ANK2, 3 dòng mang vector rỗng cho tỷ lệ nảy mầm 3 :1, có khả năng chỉ mang một bản sao T-DNA trong hệ gen.Các dòng này được chuyển ra trồng trong nhà lưới để kiểm tra lại số lượng bản sao T- DNA và chọn lọc cây đồng hợp bằng kỹ thuật qPCR theo phương pháp mô tả bởi Zhang và cộng sự. Số lượng bản sao T-DNA được đánh giá dựa trên tỷ lệ bản sao của gen HPT với gen tham chiếu Sucrose Phosphate Synthase (SPS) (U33175.1) chỉ có 1 bản sao trong hệ gen lúa. Kết quả phân tích 13 dịng T1.OE-ANK1 thu được 3 dòng mang 1 bản sao T-DNA và đồng hợp tử (24.1.3 ; 24.1.4 và 2.7.6), 5 dòng mang 1 bản sao T-DNA nhưng ở thể dị hợp (9.5.1 ; 9.5.2 ; 9.5.5 ; 9.5.12 và 2.7.5), 5 dịng có tỉ lệ 2Ct reference−Cttransgene< 0.5, chưa xác định được số lượng bản sao T-DNA và 1 dòng T1.OE-Ø đơn bản đồng hợp tử (Bảng 6).
Đối với các dòng T0.OE-ANK2, sức sống của các cây chuyển gen rất yếu. Phần lớn các dịng T0.OE-ANK2 sau khi được chuyển từ mơi trường in vitro ra mơi trường ngồi nhà kính có dấu hiệu héo dần và chết, chỉ thu được hạt của 4 dòng (5.3.2; 5.3.3; 5.3.4; 5.3.5). Kết quả đánh giá số lượng bản sao T-DNA các cây T1 chỉ xác định được dòng 5.3.5 mang 1 bản sao T-DNA, đồng hợp tử. Hai dòng 5.3.2, 5.3.4 mang hai bản sao T-DNA trong hệ gen, chưa xác định được kiểu gen, dòng 5.3.3 chưa xác định số bản sao T-DNA (Bảng 7). Số bản sao T-DNA và kiểu gen của ba dòng này sẽ được đánh giá lại ở thế hệ sau.
Bảng 6. Kết quả đánh giá số bản sao T-DNA và kiểu gen của các dòng lúa chuyển gen T1.OE-ANK1
Dòng chuyển gen
T0 Dòng chuyển gen T1 Kết quả
qPCR
Số bản sao T-
DNA Kiểu gen
T0.OE-ANK1_17.1
T1.OE-ANK1_17.1.1 0,223 Chưa xác định Chưa xác định
T1.OE-ANK1_17.1.2 0,178 Chưa xác định Chưa xác định
T1.OE-ANK1_17.1.3 0,231 Chưa xác định Chưa xác định
T1.OE-ANK1_17.1.5 0,179 Chưa xác định Chưa xác định
T0.OE-ANK1_24.1 T1.OE-ANK1_24.1.3 1,170 1 Đồng hợp T1.OE-ANK1_24.1.4 1,069 1 Đồng hợp T0.OE-ANK1_9.5 T1.OE-ANK1_9.5.1 0,575 1 Dị hợp T1.OE-ANK1_9.5.2 0,698 1 Dị hợp T1.OE-ANK1_9.5.5 0,487 1 Dị hợp T1.OE-ANK1_9.5.12 0,416 1 Dị hợp
T1.OE-ANK1_9.5.13 0,131 Chưa xác định Chưa xác định
T0.OE-ANK1_2.7
T1.OE-ANK1_2.7.5 0,519 1 Dị hợp
T1.OE-ANK1_2.7.6 1,289 1 Đồng hợp
Bảng 7. Kết quả đánh giá số bản sao T-DNA và kiểu gen của các dòng lúa chuyển gen T1.OE-ANK
Dòng chuyển gen
T0 Dòng chuyển gen T1 Kết quả
qPCR
Số bản sao T-
DNA Kiểu gen
T0.OE-ANK2_5.3
T1.OE-ANK2_5.3.2 2,352 2 Chưa xác định
T1.OE-ANK2_5.3.3 0,177 Chưa xác định Chưa xác định
T1.OE-ANK2_5.3.4 2,032 2 Chưa xác định
T1.OE-ANK2_5.3.5 1,130 1 Đồng hợp
3.4.3. Đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK1, ANK2 trong các dòng chuyển gen chuyển gen
Mức độ biểu hiện của gen ANK1 và ANK2 được đánh giá trong các dòng chuyển gen chỉ mang 1 bản sao T-DNA ở thể đồng hợp và thể dị hợp bằng qRT- PCR. Mồi CDS-ANK1-F, CDS-ANK1-R và CDS-ANK2-F, CDS-ANK2-R (Bảng
1) được thiết kế trong vùng trình tự mã hóa của 2 gen, sử dụng gen tham chiếu
ACTIN để tính mức độ biểu hiện tương đối của gen ANK.
Phân tích kết quả qRT-PCR với cặp mồi đặc hiệu của gen ANK1 cho thấy
mức độ biểu hiện của gen đều được tăng lên trong các dòng chuyển gen T1. Mức độ biểu hiện của gen ANK1 được chia thành 3 nhóm với mức độ biểu hiện khác nhau. Nhóm thứ nhất gồm hai dòng T1.OE-ANK1_2.7.5 và T1.OE-ANK1_2.7.6 có nguồn gốc từ mô sẹo chuyển gen số 2, với mức độ biểu hiện lần lượt tăng 7 và 15 lần so với cây Kitaake không chuyển gen và cây đối chứng âm T1.OE-Ø_27.0.2. Trong đó dịng T1.OE-ANK1_2.7.6 đã được xác định là đồng hợp tử, còn dòng T1.OE-ANK1_2.7.5 ở thể dị hợp. Nhóm thứ hai gồm 2 dòng đồng hợp T1.OE- ANK1_24.1.3 và T1.OE-ANK1_24.1.4 có nguồn gốc từ mơ sẹo chuyển gen số 24, mức độ biểu hiện của gen ANK1 tăng lần lượt 5400 và 5300 lần so với đối chứng.
Nhóm thứ ba gồm 5 dịng được tái sinh từ mô sẹo chuyển gen số 9, có mức độ biểu hiện của gen ANK1 tăng từ 1000-1500 lần so với các dòng đối chứng, cả 5 dòng này
đều ở thể dị hợp tử. Biểu hiện của gen ANK1 giữa các cây đối chứng âm 27.0.2 và cây Kitaake khơng có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (Hình 23).
Hình 23. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK1 trong các dòng chuyển gen
Với số lượng cây ít, sức sống kém, số hạt thu được từ các cây chuyển gen không nhiều, việc nghiên cứu ANK2 gặp nhiều khó khăn. Kết quả phân tích biểu hiện của gen ANK2 trong ba dòng T1.OE-ANK2_5.3.2; T1.OE-ANK2_5.3.4;
Hình 24. Kết quả đánh giá mức độ biểu hiện của gen ANK2 trong các dòng chuyển gen