CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.2. Thiết kế cấu trúc PTG nhằm gây đột biến gen ANK1, ANK2 bằng công nghệ
nghệ CRISPR/Cas9
3.2.1. Tạo các mảnh thành phần mang cấu trúc gRNA gây bất hoạt ANK1, ANK2 ANK2
Trong nghiên cứu này, các mảnh thành phần để tạo các cấu trúc gRNA được khuếch đại bằng phản ứng PCR với khuôn là plasmid pGTR và các mồi tương ứng (Bảng 3). Kết quả cho thấy các sản phẩm PCR đều cho sản phẩm phù hợp với tính tốn lý thuyết là: 120 bp đối với mảnh P3 và P6 (Hình 19.1-2); 140 bp đối với mảnh P1 và P4 (Hình 19. 3-4); 190 bp đối với mảnh P2, P5 và P7 (Hình 19. 5-6-7). Các mảnh PCR thành phần được trộn với nhau để tạo cấu trúc gRNA trong phản ứng Golden Gate sử dụng BsaI và T7 DNA ligase.
Hình 19. Kết quả PCR khuếch đại các mảnh thành phần tạo cấu trúc bất hoạt
ANK1, ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2.
Thang chuẩn: 8. SiZer™-100 DNA Marker Solution (Intron).1, mảnh P3; 2, mảnh P6; 3, mảnh P1; 4, mảnh P4; 5, mảnh P2; 6, mảnh P5; 7, mảnh P7.
3.2.2. Sàng lọc các cấu trúc PTG
Cấu trúc PTG-ANK1 được sàng lọc bằng cặp mồi ANK1a-F và ANK1b-R cho sản phẩm PCR có kích thước lý thuyết là 200 bp. Cấu trúc PTG-ANK2 được sàng lọc bằng cặp mồi ANK2c-F và ANK2d-R với sản phẩm PCR 200 bp. Cấu trúc PTG-ANK(1+2) được sàng lọc bằng cặp mồi ANK1a-F và ANK2d-R với sản phẩm PCR 550 bp. Kết quả (Hình 20) cho thấy: 6/22 dịng cho kết quả dương tính với cấu trúc PTG-ANK1, 20/22 dịng cho kết quả dương tính với cấu trúc PTG-ANK2, 12/23 dịng cho kết quả dương tính với cấu trúc PTG-ANK(1+2).
Hình 20. Kết quả sàng lọc các dịng E.coli mang cấu trúc PTG bất hoạt ANK1,
ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2.
1-24: sàng lọc khuẩn lạc mang cấu trúc PTG-ANK1; 26-49: sàng lọc khuẩn lạc mang cấu trúc PTG-ANK2; 51-75: sàng lọc khuẩn lạc mang cấu trúc PTG-ANK(1+2); 25, 50, 63: HighRanger 1 kb DNA Ladder (Norgen).
Giải trình tự (Bảng 5) cho thấy toàn bộ các cấu trúc đều có ít nhất một dịng plasmid cho kết quả như mong đợi. Các plasmid này được biến nạp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA105 chuẩn bị cho quy trình chuyển gen vào lúa.
Bảng 5. Kết quả giải trình tự các dịng plasmid mang cấu trúc bất hoạt ANK1,
ANK2 và bất hoạt đồng thời ANK1 và ANK2
Cấu trúc Số dịng giải trình tự Kết quả giải trình tự
PTG-ANK1 3 3/3 dịng trình tự đúng với thiết kế
PTG-ANK2 3 2/3 dịng trình tự đúng với thiết kế
PTG-ANK(1+2) 5 1/5 dịng trình tự đúng với thiết kế