CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Tạo vector chuyển gen tăng cường biểu hiện gen ANK1, ANK2
3.1.1. Phân lập trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2
Q trình phân lập đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 từ cDNA tổng số của mẫu bông non giống lúa Nipponbare được thực hiện bằng 3 phản ứng PCR lồng. Phản ứng PCR vòng 1 được thực hiện với cặp mồi thiết kế bắt cặp ở vùng 3’-UTR và 5’-UTR của mỗi gen, kích thước mong đợi của sản phẩm PCR1 là 1342 bp và 1378 bp tương ứng cho 2 gen ANK1 và ANK2. Kết quả điện di sản phẩm PCR1 cho thấy 1 băng DNA gần đúng với kích thước mong đợi của gen ANK2 trong khi đó
khơng quan sát được băng tương tự cho gen ANK1 (Hình 15A). Biểu hiện của gen ANK1 được báo cáo ở mức độ rất thấp ở giai đoạn hình thành bơng non, do đó
lượng sản phẩm PCR1 không đủ để quan sát trên gel điện di, tuy nhiên vẫn có thể sử dụng để tiếp tục khuếch đại ở các phản ứng vòng trong.
Phản ứng PCR vòng 2 sử dụng cặp mồi bắt cặp ở hai đầu vùng trình tự mã hóa mỗi gen nhằm phân lập tồn bộ đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2. Hình
ảnh điện di cho thấy sản phẩm PCR2 của cả 2 gen không đặc hiệu, tuy nhiên có băng DNA có kích thước gần như mong đợi 909 bp và 1116 bp (Hình 15B). Băng DNA đặc hiệu sau đó được cắt ra khỏi gel và tinh sạch để sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR3.
Phản ứng PCR vịng 3 nhằm gắn thêm đoạn trình tự attB1 (29 bp), attB2 (30 bp) vào đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 phục vụ gắn chúng vào vector
PC5300.OE. Hình ảnh điện di sản phẩm của phản ứng PCR3 cho thấy 2 băng đặc hiệu gần đúng với kích thước mong đợi của gen ANK1 là 968 bp và gen ANK2 là 1175 bp (Hình 15C).
Hình 15. Hình ảnh điện di sản phẩm PCR phân lập đoạn trình tự mã hóa gen
ANK1 và ANK2
A: sản phẩm PCR vòng 1. B: sản phẩm PCR vòng 2. C: sản phẩm PCR vòng 3. L: Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
3.1.2. Nhân dịng trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector nhân dòng pGEM-T Easy pGEM-T Easy
Sản phẩm PCR3 sau khi được tinh sạch và gắn thêm adenin được đưa vào vector pGEM-T Easy ở vị trí mở vịng T/T nhờ T4-DNA ligase. Plasmid sau đó biến nạp vào vi khuẩn E.coli TOP10 và sàng lọc trên mơi trường thích hợp. Sau một đêm nuôi cấy xuất hiện 2 loại khuẩn lạc màu trắng và màu xanh. Sáu khuẩn lạc màu trắng được kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA chèn trong vector nhân dòng bằng PCR với cặp mồi T7-SP6. Kích thước mong đợi của sản phẩm PCR ở các khuẩn lạc mang vector tái tổ hợp là 1144 bp và 1346 bp tương ứng cho 2 gen ANK1, ANK2.
Đối với các khuẩn lạc tự đóng vịng, kích thước sản phẩm PCR là 176 bp. Kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 16A, B) cho thấy 2 băng DNA tương ứng với 2 gen
ANK1, ANK2 gần đúng với kích thước mong đợi, như vậy các khuẩn lạc kiểm tra là
dương tính. Kết quả kiểm tra plasmid bằng enzyme giới hạn EcoRI thu được 2 băng DNA, một băng có kích thước khoảng 3.0 kb là kích thước ngun bản của vector pGEM-T Easy, băng thứ hai là đoạn DNA chứa trình tự ANK1, ANK2 (Hình 16C,
D). Các kết quả thu được cho phép khẳng định đã đưa được đoạn DNA với kích
Hình 16. Kiểm tra sự có mặt của đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 trong vector pGEM-T tái tổ hợp bằng PCR và cắt enzyme giới hạn.
A, B: sản phẩm PCR khuẩn lạc với mồi T7-SP6. C, D: sản phẩm cắt plasmid với enzyme EcoRI. Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
Kết quả giải trình tự các plasmid thu được bốn/sáu dòng mang đầy đủ, và chính xác trình tự mã hóa gen ANK1 và các trình tự attB1-attB2 (Hình 17B). Tuy
nhiên khi phân tích trình tự của 6 cấu trúc pGEM-T_CDS_ANK2 đều nhận thấy sự thiếu hụt 186 bp (toàn bộ vùng exon 2) so với trình tự tham chiếu (Hình 17C). Trình tự tham chiếu của ANK2 công bố trên các cơ sở dữ liệu là trình tự được dự
đốn dựa trên các phân tích tin sinh của trình tự nucleotide trên DNA, ANK2 chưa
từng được nghiên cứu trước đây, do đó, có thể vùng 186 bp (exon 2 trong trình tự tham chiếu) trên thực tế có thể là vùng khơng mã hóa (intron) hoặc đây là một dạng mRNA của ANK2. Để kiểm tra giả thiết này, đoạn trình tự mã hóa gen ANK2 đã
được phân lập lại từ mẫu bơng non của giống lúa mơ hình Kitaake và giải trình tự, kết quả thu được trình tự trùng khớp với trình tự của đoạn mã hóa gen ANK2 được phân lập từ giống Nipponbare, đều thiếu 186 pb so với trình tự tham chiếu được công bố trên các trang dữ liệu.
Phân tích cấu trúc protein từ trình tự thu được cho thấy gen ANK2 mã hóa
protein với 4 motif ankyrin, 3 motif TPR (trong khi trình tự tham chiếu tạo ra protein có 5 motif ankyrin, 3 motif TPR) tuy nhiên vẫn có thể tạo ra một vị trí liên kết với một phối tử sinh học khác.
Hình 17. Kết quả phân tích trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 trong vector pGEM-T Easy tái tổ hợp.
A : Vị trí mồi T7 và SP6 trong vector pGEM-T Easy sử dụng để giải trình tự đoạn DNA chèn. B : Trình tự đoạn mã hóa gen ANK1 từ mã mở đầu đến mã kết thúc và trình tự attB1, attB2. C : Cấu trúc gen ANK2 công bố trên cơ sở dữ liệu Rice Genome Annotation và cấu trúc phân tích từ dữ liệu giải trình tự của đề tài.
3.1.3. Ghép nối trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 vào vector PC5300.OE
Đoạn trình tự mã hóa gen ANK1 và ANK2 trong vector nhân dòng pGEM-T
được đưa vào vector PC5300.OE bằng công nghệ GATEWAY thông qua phản ứng tái tổ hợp giữa 2 vị trí attB1 x attP1 và attB2 x attP2, như vậy đoạn trình tự mã hóa gen ANK sẽ thay thế vị trí của gen ccdB, dưới sự điều khiển của promoter Ubiquitin.
Kiểm tra sự có mặt của đoạn DNA chèn trong vector PC5300.OE tái tổ hợp bằng phản ứng PCR với cặp mồi pUbi và ANK-R2 (Bảng 1). Kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy 1 băng đặc hiệu tương ứng với kích thước mong đợi 1132 bp ở 10/10 khuẩn lạc sàng lọc (Hình 18A). Kiểm tra 15 khuẩn lạc biến nạp với vector PC5300.OE-CDS_ANK2 thu được 7 khuẩn dương tính (Hình 18C). Sự có mặt của gen ANK1, ANK2 trong vector PC5300.OE được khẳng định lại bằng phản ứng cắt
enzyme giới hạn EcoRI, thu được 2 băng trong đó băng có kích thước bé hơn đúng
với kích thước mong đợi của gen ANK1 (1720 bp) và ANK2 (2483 bp), cịn băng có kích thước lớn hơn là phần cịn lại của vector PC5300.OE (Hình 18B, D).
Hình 18. Kiểm tra sự có mặt của đoạn trình tự mã hóa gen ANK1, ANK2 trong vector PC5300.OE tái tổ hợp bằng PCR (A, C) và cắt enzyme giới hạn EcoRI
(B,D).
Thang chuẩn: GeneRuler 1kb DNA Ladder (Thermo Scientific).
Giải trình tự các dịng biến nạp dương tính cho thấy tất cả các plasmid đều mang chính xác trình tự mã hóa các gen ANK1, ANK2. Như vậy, các trình tự mã
hóa ANK1, ANK2 đã được đưa vào vector biểu hiện PC5300.OE. Các plasmid sau
đó đã được biến nạp vào chủng vi khuẩn Agrobacterium EHA105 chuẩn bị cho quy trình chuyển gen vào lúa, các thí nghiệm kiểm tra đã được tiến hành như đối với các dòng E.coli (PCR khuẩn lạc, cắt ezyme giới hạn).