CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.2. Hoạt hóa và ni cấy tế bào
- Rã đông nhanh tế bào: Tế bào HepG2 và HEK293 đƣợc lấy ra khỏi bình nitơ lỏng đƣợc làm rã đơng nhanh trong bể ổn nhiệt 37oC, sau đó đƣợc đƣa vào ống phalcon 15 ml đã chứa sẵn 5 ml môi trƣờng nuôi cấy tƣơng ứng của tế bào HepG2 và HEK293.
- Ly tâm 1500 vòng/phút, trong 5 phút rồi bỏ dịch nổi, thu tế bào. Tế bào đƣợc hòa đều trong môi trƣờng DMEM (10% FBS, 100U/ml penicillin và 100 μg/ml streptomycin) rồi đƣợc cấy vào các đĩa nuôi cấy tế bào và đặt trong tủ ủ 37o
C có cung cấp 5% CO2.
Các tế bào đƣợc nuôi cấy từ 2-3 thế hệ trong 1 tuần và ln đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi để kiểm tra mật độ và trạng thái trƣớc khi sử dụng cho các thí nghiệm hoặc có thể đƣợc lƣu giữ bằng nitơ lỏng (cho các thí nghiệm tiếp theo).
2.3.3. Đánh giá độc tính của dịch chiết mƣớp đắng và giảo cổ lam lên dòng tế bào HepG2 và HEK293 [49]
Xử lý tế bào với dịch chiết MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng
- Các thơng tin tóm tắt của mẫu dịch chiết MĐ và GCL đƣợc trình bày ở bảng 2.3
Bảng 2.3. Ký hiệu và mô tả mẫu
TT Ký hiệu mẫu Loại mẫu Mô tả mẫu 1 Mƣớp đắng
(Thanh Hóa)
Dịch chiết thực vật
Dạng lỏng quánh, màu xanh lục đậm hơi vàng, hịa tan trong dung mơi DMSO 2 Giảo cổ lam
(Hịa Bình)
Dịch chiết thực vật
Dạng lỏng, màu xanh lục nhạt, hịa tan trong dung mơi DMSO
3 Chất kiểm chứng dƣơng CITCO
Dịch tổng hợp Dạng lỏng, màu trong, hịa tan trong dung mơi DMSO
4 Chất kiểm chứng âm PK11195
Dịch tổng hợp Dạng lỏng, màu trong, hịa tan trong dung mơi DMSO
- Nồng độ dịch chiết MĐ và GCL dùng để xử lý tế bào trong thí nghiệm kiểm tra độc tính trên hai đƣợc trình bày ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Dải nồng độ thử nghiệm của dịch chiết mướp đắng và giảo cổ lam
Chất thử
Nồng độ thử nghiệm (µg/ml)
1 2 3 4 5 6 7
MĐ 487 243,5 121,8 60,9 30,4 15,2 7,6 GCL 640 320 160 80 40 20 10
- Thơng tin về hóa chất kiểm chứng: Chất kích hoạt trực tiếp thụ thể nhân tế bào CAR là CITCO (chất kiểm chứng dƣơng) và chất ức chế là PK11195 (chất đối chứng âm). Các chất thử nghiệm CITCO và PK11195 phải đƣợc làm đồng nhất
trƣớc khi sử dụng, đƣợc pha lỗng trong mơi trƣờng ni cấy để đạt nồng độ cần thiết. Nồng độ của chất kiểm chứng dƣơng CITCO là 1 μM và đối chứng âm PK11195 là 2,5 µM có ảnh hƣởng đối với hoạt tính CAR trong các nghiên cứu trƣớc đã công bố [18, 33].
- Các tế bào HepG2 và tế bào HEK293 đƣợc nuôi cấy trong các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng với nồng độ 4 × 103 tế bào/ 180 µl môi trƣờng nuôi cấy tế bào DMEM tƣơng ứng, có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine serum), 100 U/ml penicillin và 100 µg/ml streptomycin. Đĩa ni cấy tế bào đƣợc ủ trong tủ cấy qua đêm sau đó đƣợc thay môi trƣờng và ủ với dịch chiết MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng theo các nồng độ cuối cùng nhƣ đƣợc thiết kế trong bảng 2.4.
Tiến hành đồng thời một mẫu đối chứng (không chứa chất thử nghiệm là mơi trƣờng ni cấy tế bào có nồng độ DMSO 0,5%) dùng để so sánh.
Đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ và GCL bằng hình thái tế bào
Các tế bào HepG2 và tế bào HEK293 sau khi đƣợc xử lý với dịch chiết MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng sau 48 giờ đƣợc theo dõi những thay đổi hình thái của tế bào ở các nồng độ khác nhau của dịch chiết MĐ và GCL và đƣợc quan sát bằng kính hiển vi soi ngƣợc (Carl Zeiss, Đức) sử dụng độ phóng đại vật kính 10X.
Đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ và GCL lên 02 dòng tế bào bằng thử nghiêm MTS [49]
Phƣơng pháp MTS đƣợc sử dụng theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất (Promega Corporation Cat.# G1111)
* Nguyên tắc thử nghiệm
Đánh giá tác dụng gây độc tế bào, pha lỏng thông qua chỉ số IC50 (Nồng độ chất thử gây độc tại đó chất thử ức chế sự sống 50% tế bào) trên hai dòng tế bào HepG2 (tế bào ung thƣ gan ngƣời) và tế bào HEK293 (tế bào thận phôi ngƣời). Các tế bào thử nghiệm đƣợc tiếp xúc với mơi trƣờng ni cấy có bổ sung chất nghiên cứu và dãy nồng độ chất thử nhất định. Chỉ số IC50 đƣợc xác định sau 48 giờ ủ với
chất thử nghiệm. Nồng độ chất ức chế càng cao thì hoạt tính ức chế càng thấp, nghĩa là giá trị IC50 càng cao đồng nghĩa với chất thử nghiệm càng ít độc.
Sau khi xử lý tế bào với dịch chiết thực vật và hóa chất kiểm chứng trong vịng 48 giờ, mẫu đƣợc đem phân tích tính độc lên các dịng tế bào thử nghiệm bằng bộ kit phân tích khả năng sinh trƣởng tế bào MTS (tetrazolium: 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)2H-
tetrazolium)
* Nguyên lý phép đo
MTS là một phân tích khả năng gây độc khảo nghiệm và khả năng tăng sinh tế bào thông qua phản ứng định lƣợng màu có độ nhạy cao. Phân tích này dựa trên việc giảm của hợp chất MTS tetrazolium cho q trình chuyển hóa thành sản phẩm formazan trong tế bào sống, đƣợc hịa tan trong mơi trƣờng nuôi cấy tế bào. Sự chuyển đổi này đƣợc thực hiện bởi NAD(P)H phụ thuộc vào enzyme dehydrogennase trong hoạt động trao đổi chất của tế bào. Các chất màu formazan đƣợc tạo ra bởi tế bào sống có thể đƣợc định lƣợng bằng cách đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng từ 490-500nm. Nguyên lý của phân tích đƣợc thể hiện ở hình 2.4.
* Quy trình thực hiện
Hút bỏ 100 µl mơi trƣờng ở mỗi giếng và bổ sung vào 20 µl dung dịch nhuộm MTS, đảm bảo dịch nhuộm đƣợc phân bố đều trong mỗi giếng và ủ trong 4 giờ ở 37oC. Ở bƣớc này dung dịch cần đƣợc bọc kín để tránh ánh sáng.
Bổ sung vào giếng 100 µl hỗn hợp dung dịch hòa tan/ dừng phản ứng, gõ nhẹ đĩa và ủ trong 1 giờ.
Đo mật độ quang học của dung dịch trong giếng bằng máy Microplate Reader ở bƣớc sóng 490 nm.
Dựa vào giá trị mật độ quang học, ta xác định đƣợc % tỷ số tăng sinh (A) của tế bào, từ đó đánh giá đƣợc độ độc đối với tế bào của chất thử nghiệm. Giá trị A đƣợc tính theo cơng thức sau:
A(%) = × 100
Trong đó: VH là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi pha thuốc.
T là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với thuốc
Nếu A=50% có nghĩa là thuốc có tác dụng gây độc và làm chết 50% tế bào. Nồng độ thuốc mà tại đó giá trị A đạt 50% gọi là liều gây ức chế tăng sinh 50% tế bào, ký hiệu là IC50. Đây là giá trị để đánh giá độc tính của chất thử nghiệm đối với tế bào.
* Mục đích thử nghiệm
- Đánh giá đƣợc độc tính của dịch chiết tổng số của MĐ và GCL trên hai dòng tế bào ung thƣ gan (HepG2) và tế bào thận phôi ngƣời (HEK293) sau 48h, từ đó đánh giá đƣợc khả năng kháng ung thƣ của hai dịch chiết này.
- Định hƣớng đƣợc nồng độ của dịch chiết thử nghiệm trên hai dịng tế bào trong các thí nghiệm tiếp theo (nồng độ an tồn với hai dịng tế bào) để chứng minh
và giải thích vai trị của các yếu tố tham gia vào quá trình giải độc cho cơ thể (thụ thể nhân tế bào Constitutive androstane) đáp ứng đối với dịch chiết MĐ và GCL.
Xác định giá trị IC50
Chỉ số IC50 (Nồng độ chất thử nghiệm tại đó chất thử nghiệm có khả năng ức chế sự sống 50% tế bào) sau 48h ủ bằng thử nghiệm MTS.
- Chỉ số IC50 của một chất với một dịng tế bào đƣợc tính là nghiệm phƣơng trình hồi quy biểu diễn tƣơng quan giữa x là nồng độ hoặc log nồng độ chất thử đó và y là chỉ số tăng sinh A% của dịng tế bào đó khi đƣợc ủ với chất thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau, khi y = 50%.