Mồi Trình tự mồi hCAR-F 5’ - TGGTACTGCAAGTCATCAAGT - 3’ hCAR-R 5’ - CTTCAATTGTGTAGCGAAGAG - 3’ hCYP2B6-F 5’ - AGACGCCTTCAATCCTGACC - 3’ hCYP2B6-R 5’ - CCTTCACCAAGACAAATCCGC - 3’ hβ-actin-F 5’ - TGACCCAGATCATGTTTGAGA - 3’ hβ-actin-R 5’ - TACGGCCAGAGGCGTACAGC - 3’ 2.3.4.3. Western Blot
Phƣơng pháp Western blot đƣợc thực hiện dựa theo phƣơng pháp của các công bố trƣớc [24, 46].
Mục đích
Trong nghiên cứu này kỹ thuật lai Western blot đƣợc thực hiện nhằm đánh giá mức độ biểu hiện protein CAR trong hai dòng tế bào HepG2 và dòng tế bào HEK293 sau khi đƣợc xử lý với MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng.
Nguyên lý:
Western Blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein (kháng nguyên - kháng thể). Protein kháng nguyên đƣợc phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.
Trong Western Blot, một hỗn hợp protein đƣợc phân tách bằng điện di SDS- PAGE. Các băng protein đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose và từng băng protein đƣợc phát hiện bằng cách ngâm màng PVDF với kháng thể đơn dịng và đa dịng có gắn enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm. Nếu protein quan tâm đƣợc kết hợp đặc hiệu bởi kháng thể đánh dấu, vị trí của nó có thể đƣợc phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm fim X quang.
Quy trình
Bước 1: Xử lý mẫu
Các tế bào HepG2 và HEK293 (3×105 tế bào/ml) đƣợc nuôi trong đĩa 6 giếng qua đêm, tiếp đó tế bào đƣợc ủ với dịch chiết MĐ hoặc dịch chiết GCL ở nồng độ xác định. Sau 24 giờ, tế bào đƣợc thu và đƣợc ly giải để tách protein tổng số bằng đệm RIPA (Thermor scientific), mẫu đƣợc xử lý với đệm Lamelli 5X.
Bước 2: Điện di trên gel
Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trên sự phân tách protein theo trọng lƣợng phân tử, trong hệ gel polyacrylamide.
Phƣơng pháp SDS-PAGE (điện di trên gel polyacrylamide biến tính) giữ các polypeptide ở trạng thái biến tính và mất đi cấu trúc bậc 2 và bậc 3 và do đó các protein đƣợc phân tách trên gel trong điện trƣờng.
Bảng 2.6. Thành phần của gel SDS-PAGE 10%
Thành phần Gel tách 10 % Gel cô 4% 30% polyacrylamide 1,7 ml 0,34 ml 1,5M Tris HCl, pH 8,8 1,3 ml - 1M Tris HCl, pH 6,8 - 0,25 ml 10% SDS 0,05 ml 0,02 ml APS 10% 0,05 ml 0,02 ml TEMED 0,002 0,002 ml H2O 1,8 ml 1,36 ml Tổng thể tích 5 ml 2 ml Hàm lƣợng protein tổng số cho vào mỗi giếng là 20 μg/giếng.
Chạy gel SDS-PAGE 10 %, điện áp 120V, 80mA (Chạy hệ trong đệm Runing Bufer ở điện áp 80V, 50 mA trong vịng 20 phút, sau đó chạy hệ ở 120V,
150 mA đến khi marker chạy gần hết gel tách - tùy thuộc vào khích thƣớc của protein đích mà ta chọn thời điểm dừng cho phù hợp).
Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai
Sau khi chạy điện di SDS-PAGE 15%, tiến hành chuyển lên màng Hybond-P (GE Health Sciences, Mỹ). Các protein đƣợc di chuyển từ gel lên màng mà vẫn giữ nguyên đƣợc sự sắp xếp nhƣ trên bản gel. Sử dụng phƣơng pháp thẩm tách điện và dùng dòng điện 1 chiều để kéo protein từ gel lên màng, chạy hệ trong đệm chuyển ở điện áp 15V, 80mA trong 1 giờ 20 phút. Kết quả là protein sẽ đƣợc phơi ra trên lớp mỏng bề mặt để tiến hành xác định.
Bước 4: Xử lý màng lai (Blocking)
Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên ta thực hiện bƣớc này để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể đƣợc sử dụng để xác định protein mục tiêu. Block màng bằng dung dịch protein lỗng albumin huyết tƣơng bị 5 % (BSA 5%) trong TBS 1X, 0,1% Tween 20 trong 1 giờ sau đó rửa sạch màng bằng PBST.
Bước 5: Q trình lai và phát hiện vị trí lai
- Lai với kháng thể sơ cấp: Protein trên màng đƣợc ủ với kháng thể đặc hiệu kháng hCAR hoặc β-actin (Cell Signaling, Mỹ), ủ qua đêm, lắc nhẹ ở 4oC. Sau khi ủ xong kháng thể sơ cấp, tiến hành rửa màng bằng dung dịch 1x T-PBS 3 lần, mỗi lần 5 phút.
- Gắn kháng thể thứ cấp: Ủ với kháng thể 2 là kháng thể thứ cấp anti rabit antibody có gắn HRP (horseradish peroxidase-conjugated antibody). Sau đó rửa màng bằng 1x T-PBS 3 lần, mỗi lần 10 phút. Màng sau đó đƣợc ủ với cơ chất ECL (NEB, Mỹ) và băng tín hiệu đƣợc nhận diện bằng tín hiệu X-quang trên phim.
2.3.5. Xử lý số liệu
Các số liệu đƣợc xử lý bằng phần mềm Excel và phần mềm GraphPad Prism 5.0 để phân tích thống kê và tính giá trị IC50.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Đặc điểm sinh thái của mƣớp đắng và giảo cổ lam 3.1. Đặc điểm sinh thái của mƣớp đắng và giảo cổ lam
3.1.1. Đặc điểm sinh thái của mƣớp đắng [48]
Khí hậu, đất đại
Lồi MĐ có biên độ sinh thái tƣơng đối rộng, nhiệt độ thích hợp cho cây sinh trƣởng vào từ 20-35oC, lƣợng mƣa trung bình hàng năm từ 1500-2500 mm. MĐ có thể chịu đƣợc nhiều điều kiện đất khác nhau, nhƣng phát triển tốt nhất trong điều kiện đất thoáng nƣớc và giàu chất hữu cơ. Cây MĐ có thể trồng quanh năm, nhƣng cây sinh trƣởng nhanh nhất trong mùa mƣa ẩm. Hoa thụ phấn chủ yếu là nhờ côn trùng. Sau khi quả già, cây sẽ tàn lụi và kết thúc vòng đời sau 4-5 tháng.
Phân bố
MĐ phân bố chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và cận nhiệt đới trên khắp các châu lục. Từ thời xƣa, cây MĐ đƣợc trồng ở vùng Đơng Ấn và Nam Trung Quốc, ở đây nó đƣợc sử dụng nhƣ các loại rau quả giàu chất sắt và vitamin C. Sau đó cây đã đƣợc du nhập sang châu Phi và châu Mỹ Latinh. Đến nay quần thể MĐ đã trở lên rất phong phú và có mặt ở hầu hết các nƣớc nhiệt đới, cận nhiệt đới nhƣ: Trung Quốc (Phúc Kiến, Quảng Đông, Quảng Tây, Chiết Giang, Giang Tô,...); một số nƣớc đông nam châu Á nhƣ Ấn Độ, Malaysia, Philippin, châu Phi và vùng Caribbean.
Ở Việt Nam, MĐ đƣợc trồng hầu khắp ở các tỉnh từ Bắc vào Nam. Do thích hợp với khí hậu vùng nhiệt đới nên chỉ ở một số vùng núi cao và lạnh nhƣ SaPa (Lào Cai), Phó Bảng (Hà Giang),... thì mới khơng thấy có sự phân bố của MĐ.
3.1.2. Đặc điểm sinh thái của giảo cổ lam [77]
Khí hậu, đất đai
Cây sinh trƣởng tốt nơi ánh sáng yếu (ánh sáng tán xạ) và đất ẩm hoặc hơi chịu bóng, thƣờng leo trùm lên các tảng đá, hay những cây bụi, dây leo khác ở ven
hiện tƣợng bán tàn lụi, sinh trƣởng mạnh trong mùa mƣa ẩm. Mùa hoa quả tháng 6- 10. Tái sinh tự nhiên chủ yếu từ hạt, và mọc chồi nhiều từ các phần sau khi cắt. Cây GCL có thể phát triển ở hầu hết các vùng khí hậu mát, ẩm. Khu phân bố tự nhiên có nhiệt độ bình quân là 16,1oC, nhiệt độ cao nhất là 28,8o
C, nhiệt độ thấp nhất 3,6oC. tuy nhiên cây có thể chịu đƣợc nhiệt độ cao nhất là 39,7oC, thấp nhất là -9,6oC.
Cây có thể sinh trƣởng, phát triển trên nhiều loại đất nhƣ đất cát, đất mùn, đất thịt. Đất trồng cần thoát nƣớc tốt nhƣng phải giữ đƣợc ẩm, đất giàu dinh dƣỡng, đặc biệt là đạm. Độ ẩm thích hợp trung bình là 75%, hàm lƣợng nƣớc trong đất 25- 40%.
Phân bố
Gynostemma Blum phân bố chủ yếu ở vùng nhiệt đới châu Á và Đông Nam
Á từ Hymalaya tới Nhật Bản, Malaysia và New Guinea. Loài Gynostemma pentaphyllum (Thunb) Makino là lồi phổ biến nhất, nó phân bố ở Ấn Độ, Nepal, Bangladesh, Hàn Quốc, Nhật Bản, Srilanca, Lào, Myama và Việt Nam. Hiện nay giảo cổ lam 5 lá cũng đã đƣợc tìm thấy trên các vùng núi cao ở các tỉnh phía Bắc nhƣ Cao Bằng, Thái Ngun, n Bái, Hà Giang, Hịa Bình.
3.2. Độc tính của dịch chiết mƣớp đắng và giảo cổ lam lên các dịng tế bào 3.2.1. Độc tính của dịch chiết mƣớp đắng lên các dịng tế bào 3.2.1. Độc tính của dịch chiết mƣớp đắng lên các dịng tế bào
Ảnh hưởng của dịch chiết mướp đắng lên hình thái tế bào
Sự thay đổi về hình thái tế bào chính là một tiêu chí quan trọng để đánh giá độc tính của của dịch chiết MĐ. Các tế bào đƣợc xử lý ở các nồng độ khác nhau của dịch chiết MĐ và quan sát sự thay đổi hình thái sau 48 giờ. Những thay đổi về hình thái của hai dịng tế bào HepG2 đƣợc thể hiện ở hình 3.1.
Nồng độ dịch chiết MĐ
(μg/ml)
Dòng tế bào HepG2 Dòng tế bào HEK 293
Control
15,2
30,4
121,8
243,5
487,0
Hình 3.1. Sự thay đổi về hình thái của 02 dịng tế bào HepG2 và HEK293 khi đáp ứng với dịch chiết mướp đắng ở các nồng độ khác nhau khi đáp ứng với dịch chiết mướp đắng ở các nồng độ khác nhau
bắt đầu có sự thay đổi tại nồng độ 121,8 µg/ml, co trịn giảm sức bám dính bề mặt rõ rệt từ các nồng độ tiếp theo (243,5 μg/ml) và gây chết tế bào ở nồng độ 487 µg/ml. Trong khi đó đối với tế bào HEK293, khoảng nồng độ từ 7,6 µg/ml đến 30,4 µg/ml khơng làm thay đổi đáng kể hình thái tế bào. Sự thay đổi hình thái tế bào đã bắt đầu xuất hiện ở nồng độ dịch chiết là trên 60,9 µg/ml (tế bào bắt đầu co lại) và thay đổi mạnh mẽ khi đƣợc xử lý với dịch chiết MĐ từ nồng độ 121,8 đến 487 μg/ml, tế bào co cụm, khơng bám dính và chết. Kết quả cho thấy khi xử lý với dịch chiết MĐ thì dịng tế bào HEK293 đã bị thay đổi hình thái ở nồng độ thấp hơn so với dòng tế bào HepG2. Điều đó chứng tỏ trong đáp ứng bằng sự thay đổi hình thái tế vào đối với dịch chiết MĐ thì dịng tế bào HEK293 nhạy cảm hơn so với dòng tế bào HepG2.
Đối với các dòng tế bào khi đáp ứng với dịch chiết MĐ chiều hƣớng biến đổi của nó là co trịn lại, trơi nổi tách ra khỏi đáy của đĩa ni cấy, hình thành các bóng trịn nhỏ, mảnh vỡ tách ra khỏi tế bào. Xu hƣớng thay đổi hình thái này tƣơng tự nhƣ dạng tế bào chết kiểu apoptosis [76, 36]. Apoptosis là hiện tƣợng tế bào chết theo chƣơng trình. Nó bao gồm sự ngƣng tụ của của tế bào chất và nhân, ADN và NST sẽ bị phân cắt, sau cùng hình thành các túi, bóng trịn chính là các thể apoptosis và đây cũng chính là yếu tố góp phần vào sự ức chế tăng trƣởng của tế bào ung thƣ [76, 36].
Sự thay đổi về hình thái của hai dịng tế bào khi đáp ứng với dịch chiết MĐ tƣơng tự với sự thay đổi hình thái của tế bào trong q trình apoptosis nhƣ đã cơng bố trong một số nghiên cứu trƣớc đây. Điển hình nhƣ một cơng bố của “Chaitanya Joshi và cộng sự, năm 2012” [20] khi nghiên cứu về hình thái tế bào trong quá trình apoptosis trên tế bào u não của chuột (hình 3.2).
Hình 3.2. Sự biến đổi về hình thái của các tế bào u não chuột trong quá trình apoptosis.
Tế bào ở trạng thái bình thƣờng (hình bên trái) và tế bào đang đi vào quá trình apotosis (hình bên phải) [20]
Kết quả cho thấy sự biến đổi về hình thái trong hai dịng tế bào HepG2 và HEK293 khi đáp ứng với dịch chiết MĐ khá giống sự biến đổi về hình của tế bào u não chuột trong quá trình apoptosis. Quan sát thấy các tế bào co trịn, sau đó co cụm lại và gây chết tế bào. Nhƣ vậy có thể thấy khi xử lý với dịch chiết MĐ ở nồng độ cao (từ 121,8 μg/ml) thì cả tế bào ung thƣ và tế bào thƣờng đều có hiện tƣợng chết. Sự chết tế bào này có thể đƣợc dự đoán là hiện tƣợng tế bào trải qua con đƣờng apoptosis. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn sự chết của các tế bào có thực sự là hiện tƣợng apoptosis hay khơng thì các nghiên cứu phân tử khác chứng minh sự có mặt các dấu ấn phân tử của sự chết apotosis dƣới tác động của dịch chiết MĐ cần phải đƣợc tiến hành.
Ảnh hưởng của dịch chiết mướp đắng lên sự sinh trưởng của dòng tế bào HepG2 và HEK293.
Để đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ trên các dòng tế bào HepG2 và HEK293, sự sinh trƣởng của các tế bào dƣới ảnh hƣởng của dịch chiết MĐ đã đƣợc xác định bằng thử nghiệm MTS ở các nồng độ dịch chiết khác nhau. Khả năng sống của các tế bào sau 48 giờ ủ với dịch chiết đã đƣợc sử dụng để xác định giá trị IC50
làm cơ sở cho việc đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ với các dòng tế bào. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.3.
Bảng 3.1. Độc tính của mướp đắng lên hai dịng tế bào HepG2 và HEK293
Nồng độ dịch chiết MĐ
(g/ml)
Khả năng sống sót của tế bào (%)± SEM, n=3
Giá trị IC50 (g/ml) HepG2 HEK293 HepG2 HEK293
7,6 86,43± 10,27 87,09± 3,46 166,2 108,9 15,2 86,54± 2,98 84,44± 3,16 30,4 86,25± 8,29 83,90± 5,56 60,9 80,27± 0,37 75,85± 0,27 121,8 78,39±1,51 39,75± 0,16 243,5 23,34± 0,87 37,08± 1,25 487,0 0,44± 0,14 0,97± 0,31
Dòng tế bào ung thƣ của ngƣời (HepG2) đƣợc chọn làm mơ hình nghiên cứu trong đề tài này do sự phổ biến của nhiều cái chết liên quan đến ung thƣ gan ở Việt Nam và trên toàn thể giới hiện nay, hơn nữa gan cũng là cơ quan tham gia chính vào q trình giải độc cho cơ thể. Vì vậy sử dụng dịng tế HepG2 vừa đánh giá đƣợc độc tính của dịch chiết MĐ đối với cơ thể, lại vừa là một nhiệm vụ cấp bách để phát triển mơ hình thực nghiệm chống lại căn bệnh ung thƣ chết ngƣời này. Bên cạnh đó, dịng tế bào bình thƣờng HEK293 cũng đƣợc sử dụng để đánh giá nguy cơ ảnh hƣởng của dịch chiết MĐ đối với các tế bào thƣờng trong quá trình điều trị ung thƣ.
Bảng 3.1 và hình 3.3 cho thấy tại nồng độ 7,6 μg/ml khả năng tồn tại của tế bào đã giảm xuống 87- 86 % ở cả hai dòng tế bào. Tuy nhiên mức độ chết của mỗi dòng tế bào là khác nhau ở các nồng độ dịch chiết khác nhau. Đối với dòng tế bào HepG2, khơng có sự khác biệt đáng kể về khả năng sống ở trong khoảng nồng độ từ 7,6- 60,9 µg/ml (khả năng tồn tại của tế bào luôn giữ xấp xỉ khoảng 80-86 %). Tuy nhiên tỷ lệ sống của các tế bào này đã giảm xuống cịn 78,39% tại nồng độ 121,8 µg/ml và giảm mạnh ở nồng độ 243,5 µg/ml (tỷ lệ sống chỉ cịn 23,34%) và giảm hoàn toàn ở nồng độ 487,5 µg/ml (tỷ lệ sống chỉ cịn 0,44%). Trong khi đó, khả năng tồn tại của tế bào HEK293 không khác biệt nhiều khi xử lý tế bào tại các nồng độ từ 7,7-30,4 µg/ml. Tỷ lệ tế bào sống giảm xuống còn 75% tại nồng độ 60,9 µg/ml và giảm mạnh xuống còn 39,75% và 37,08% tại nồng độ 121,8 µg/ml và 243,5 µg/ml. Tỷ lệ sống sót giảm gần nhƣ hồn ở nồng độ cuối 487,0 µg/ml.
Nhƣ vậy sức sống tế bào sống gần nhƣ hết ở cả hai dòng tế bào HepG2 và HEK293 khi đáp ứng với nồng độ cao nhất của dịch chiết MĐ (487,0 µg/ml). Các kết quả thử đƣợc từ phép thử độc tính bằng thử nghiệm MTS là hoàn toàn phù hợp với các kết quả phân tích hình thái học ở trên.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, dịch chiết MĐ đã thể hiện độc tính của nó trên tế bào ung thƣ gan HepG2 và tế bào thƣờng HEK293 với giá trị IC50 tƣơng ứng là 166,2 µg/ml và 108,9 µg/ml (bảng 3.1). Điều này đã chứng tỏ rằng tế bào HEK293 nhạy cảm hơn với dịch chiết tổng số MĐ so với dịng tế bào HepG2.
Đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng khác của MĐ, đặc biệt là trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đƣờng và mỡ máu [11, 70]. Nồng độ và liều lƣợng nhỏ hơn giá trị IC50 của mỗi dòng tế bào khi đáp ứng với dịch chiết MĐ trong đề tài này đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng tiếp theo. Các kết quả về độc tính của dịch chiết MĐ có thể là cơ sở để giải thích về tác dụng phụ khi sử dụng MĐ làm