Bảng 2.3. Ký hiệu và mô tả mẫu
TT Ký hiệu mẫu Loại mẫu Mô tả mẫu 1 Mƣớp đắng
(Thanh Hóa)
Dịch chiết thực vật
Dạng lỏng quánh, màu xanh lục đậm hơi vàng, hịa tan trong dung mơi DMSO 2 Giảo cổ lam
(Hịa Bình)
Dịch chiết thực vật
Dạng lỏng, màu xanh lục nhạt, hịa tan trong dung mơi DMSO
3 Chất kiểm chứng dƣơng CITCO
Dịch tổng hợp Dạng lỏng, màu trong, hịa tan trong dung mơi DMSO
4 Chất kiểm chứng âm PK11195
Dịch tổng hợp Dạng lỏng, màu trong, hịa tan trong dung mơi DMSO
- Nồng độ dịch chiết MĐ và GCL dùng để xử lý tế bào trong thí nghiệm kiểm tra độc tính trên hai đƣợc trình bày ở bảng 2.4.
Bảng 2.4. Dải nồng độ thử nghiệm của dịch chiết mướp đắng và giảo cổ lam
Chất thử
Nồng độ thử nghiệm (µg/ml)
1 2 3 4 5 6 7
MĐ 487 243,5 121,8 60,9 30,4 15,2 7,6 GCL 640 320 160 80 40 20 10
- Thơng tin về hóa chất kiểm chứng: Chất kích hoạt trực tiếp thụ thể nhân tế bào CAR là CITCO (chất kiểm chứng dƣơng) và chất ức chế là PK11195 (chất đối chứng âm). Các chất thử nghiệm CITCO và PK11195 phải đƣợc làm đồng nhất
trƣớc khi sử dụng, đƣợc pha lỗng trong mơi trƣờng ni cấy để đạt nồng độ cần thiết. Nồng độ của chất kiểm chứng dƣơng CITCO là 1 μM và đối chứng âm PK11195 là 2,5 µM có ảnh hƣởng đối với hoạt tính CAR trong các nghiên cứu trƣớc đã công bố [18, 33].
- Các tế bào HepG2 và tế bào HEK293 đƣợc nuôi cấy trong các giếng của đĩa nuôi cấy 96 giếng với nồng độ 4 × 103 tế bào/ 180 µl mơi trƣờng ni cấy tế bào DMEM tƣơng ứng, có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine serum), 100 U/ml penicillin và 100 µg/ml streptomycin. Đĩa ni cấy tế bào đƣợc ủ trong tủ cấy qua đêm sau đó đƣợc thay môi trƣờng và ủ với dịch chiết MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng theo các nồng độ cuối cùng nhƣ đƣợc thiết kế trong bảng 2.4.
Tiến hành đồng thời một mẫu đối chứng (không chứa chất thử nghiệm là mơi trƣờng ni cấy tế bào có nồng độ DMSO 0,5%) dùng để so sánh.
Đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ và GCL bằng hình thái tế bào
Các tế bào HepG2 và tế bào HEK293 sau khi đƣợc xử lý với dịch chiết MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng sau 48 giờ đƣợc theo dõi những thay đổi hình thái của tế bào ở các nồng độ khác nhau của dịch chiết MĐ và GCL và đƣợc quan sát bằng kính hiển vi soi ngƣợc (Carl Zeiss, Đức) sử dụng độ phóng đại vật kính 10X.
Đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ và GCL lên 02 dòng tế bào bằng thử nghiêm MTS [49]
Phƣơng pháp MTS đƣợc sử dụng theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất (Promega Corporation Cat.# G1111)
* Nguyên tắc thử nghiệm
Đánh giá tác dụng gây độc tế bào, pha lỏng thông qua chỉ số IC50 (Nồng độ chất thử gây độc tại đó chất thử ức chế sự sống 50% tế bào) trên hai dòng tế bào HepG2 (tế bào ung thƣ gan ngƣời) và tế bào HEK293 (tế bào thận phôi ngƣời). Các tế bào thử nghiệm đƣợc tiếp xúc với mơi trƣờng ni cấy có bổ sung chất nghiên cứu và dãy nồng độ chất thử nhất định. Chỉ số IC50 đƣợc xác định sau 48 giờ ủ với
chất thử nghiệm. Nồng độ chất ức chế càng cao thì hoạt tính ức chế càng thấp, nghĩa là giá trị IC50 càng cao đồng nghĩa với chất thử nghiệm càng ít độc.
Sau khi xử lý tế bào với dịch chiết thực vật và hóa chất kiểm chứng trong vòng 48 giờ, mẫu đƣợc đem phân tích tính độc lên các dịng tế bào thử nghiệm bằng bộ kit phân tích khả năng sinh trƣởng tế bào MTS (tetrazolium: 3-(4,5- dimethylthiazol-2-yl)-5-(3-carboxymethoxyphenyl)-2-(4-sulfophenyl)2H-
tetrazolium)
* Nguyên lý phép đo
MTS là một phân tích khả năng gây độc khảo nghiệm và khả năng tăng sinh tế bào thơng qua phản ứng định lƣợng màu có độ nhạy cao. Phân tích này dựa trên việc giảm của hợp chất MTS tetrazolium cho q trình chuyển hóa thành sản phẩm formazan trong tế bào sống, đƣợc hịa tan trong mơi trƣờng nuôi cấy tế bào. Sự chuyển đổi này đƣợc thực hiện bởi NAD(P)H phụ thuộc vào enzyme dehydrogennase trong hoạt động trao đổi chất của tế bào. Các chất màu formazan đƣợc tạo ra bởi tế bào sống có thể đƣợc định lƣợng bằng cách đo độ hấp thụ ở bƣớc sóng từ 490-500nm. Nguyên lý của phân tích đƣợc thể hiện ở hình 2.4.
* Quy trình thực hiện
Hút bỏ 100 µl mơi trƣờng ở mỗi giếng và bổ sung vào 20 µl dung dịch nhuộm MTS, đảm bảo dịch nhuộm đƣợc phân bố đều trong mỗi giếng và ủ trong 4 giờ ở 37oC. Ở bƣớc này dung dịch cần đƣợc bọc kín để tránh ánh sáng.
Bổ sung vào giếng 100 µl hỗn hợp dung dịch hòa tan/ dừng phản ứng, gõ nhẹ đĩa và ủ trong 1 giờ.
Đo mật độ quang học của dung dịch trong giếng bằng máy Microplate Reader ở bƣớc sóng 490 nm.
Dựa vào giá trị mật độ quang học, ta xác định đƣợc % tỷ số tăng sinh (A) của tế bào, từ đó đánh giá đƣợc độ độc đối với tế bào của chất thử nghiệm. Giá trị A đƣợc tính theo cơng thức sau:
A(%) = × 100
Trong đó: VH là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với dung môi pha thuốc.
T là giá trị trung bình của mật độ quang học ở các giếng thử với thuốc
Nếu A=50% có nghĩa là thuốc có tác dụng gây độc và làm chết 50% tế bào. Nồng độ thuốc mà tại đó giá trị A đạt 50% gọi là liều gây ức chế tăng sinh 50% tế bào, ký hiệu là IC50. Đây là giá trị để đánh giá độc tính của chất thử nghiệm đối với tế bào.
* Mục đích thử nghiệm
- Đánh giá đƣợc độc tính của dịch chiết tổng số của MĐ và GCL trên hai dòng tế bào ung thƣ gan (HepG2) và tế bào thận phôi ngƣời (HEK293) sau 48h, từ đó đánh giá đƣợc khả năng kháng ung thƣ của hai dịch chiết này.
- Định hƣớng đƣợc nồng độ của dịch chiết thử nghiệm trên hai dịng tế bào trong các thí nghiệm tiếp theo (nồng độ an tồn với hai dịng tế bào) để chứng minh
và giải thích vai trị của các yếu tố tham gia vào quá trình giải độc cho cơ thể (thụ thể nhân tế bào Constitutive androstane) đáp ứng đối với dịch chiết MĐ và GCL.
Xác định giá trị IC50
Chỉ số IC50 (Nồng độ chất thử nghiệm tại đó chất thử nghiệm có khả năng ức chế sự sống 50% tế bào) sau 48h ủ bằng thử nghiệm MTS.
- Chỉ số IC50 của một chất với một dịng tế bào đƣợc tính là nghiệm phƣơng trình hồi quy biểu diễn tƣơng quan giữa x là nồng độ hoặc log nồng độ chất thử đó và y là chỉ số tăng sinh A% của dịng tế bào đó khi đƣợc ủ với chất thử nghiệm ở các nồng độ khác nhau, khi y = 50%.
2.3.4. Đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết mƣớp đắng và giảo cổ lam lên biểu hiện của gen CAR và gen CYP2B6 hiện của gen CAR và gen CYP2B6
2.3.4.1 Xử lý tế bào với các dịch chiết mƣớp đắng, giảo cổ lam và hóa chất kiểm chứng
Các tế bào HepG2 và HEK293 (3 × 105 tế bào/ml) đƣợc nuôi cấy vào các giếng của đĩa 6 giếng qua đêm, sẽ đƣợc thay môi trƣờng khơng có huyết thanh để các tế bào ngừng sinh trƣởng và dễ dàng hấp thụ các chất có trong mơi trƣờng. Bổ sung các dịch chiết MĐ hoặc GCL theo các nồng độ và hóa chất kiểm chứng nhƣ sau:
- Thí nghiệm 1: đối chứng với dung mơi DMSO
- Thí nghiệm 2: kiểm chứng phƣơng pháp, dựa trên các nghiên cứu trƣớc kia về tác động của CITCO hoạt hóa hoạt tính của CAR với nồng độ 1 μM [33] và PK11195 ức chế hoạt tính của CAR với nồng độ 2,5 μM [18].
- Thí nghiệm 3: Thử dịch chiết đơn của từng loại MĐ và GCL. Các dịch chiết MĐ và GCL đƣợc chuẩn bị với dải nồng độ dựa trên giá trị IC50 thu đƣợc ở thí nghiệm độc tính, để sàng lọc mức độ ảnh hƣởng, sau đó thiết kế lại dải nồng độ của dịch chiết có khả năng ảnh hƣởng tới mức độ biểu hiện của gen CAR và gen CYP2B6 tham gia vào quá trình giải độc trong tế bào.
- Các dịch chiết và hóa chất đƣợc ủ với tế bào thử nghiệm sau 24h trong điều kiện nuôi cấy tế bào (37oC và 5% CO2), sau đó thu tế bào và chuẩn bị cho phân tích biểu hiện mARN hay protein của gen CAR và CYP2B6.
2.3.4.2. Thực hiện phản ứng qRT- PCR
Mục đích:
Trong nghiên cứu này, Real-time PCR đƣợc thực hiện với mẫu cDNA (đƣợc tạo ra từ phản ứng RT) nhằm định lƣợng tƣơng đối số bản phiên mã của các gen
CAR (mã hóa cho protein CAR là thụ thể nhân tế bào điều chỉnh các gen đích tham
gia vào q trình giải độc cho cơ thể) và gen CYP2B6 là gen đích của thụ thể CAR (gen CYP2B6 mã hóa cho enzyme tham gia vào quá trình giải độc pha I). Qua đó sẽ đánh giá đƣợc mức độ biểu hiện mARN của các gen này sau khi xử lý với dịch chiết MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng.
Tách RNA tổng số bằng dung dịch TRNzol (Tách RNA theo khuyến cáo của nhà sản xuất (TRIzol RNA Isolation Reagents, Thermo Fisher Scientific)
Các tế bào HepG2 và HEK293 đã đƣợc ủ với MĐ, GCL, DMSO, CITCO, PK11195 với nồng độ nhất định (nồng độ đƣợc thiết kế dựa trên sau khi đã đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ và GCL trên hai dòng tế bào HepG2 và HEK293).
Nguyên lý tách chiết RNA
- Các phân tử RNA thƣờng không bền, dễ bị phân hủy bởi Rnase. Bởi vậy, việc tách RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trƣờng thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ hóa chất đều đƣợc khử trùng bằng nhiệt.
- Để thu nhận RNA tinh sạch, ngƣời ta cần loại các thành phần tạp nhiễm, đặc biệt là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid, protein) trong 2 pha không tan (phenol, chloroform/nƣớc).
Quy trình
- Đồng nhất mẫu: Mẫu tế bào sau khi đƣợc ủ với MĐ, GCL, DMSO, CITCO, PK11195 sẽ đƣợc đồng nhất với dung dịch TRNzol (sau khi đồng nhất trong TRNzol có thể đƣợc lƣu giữ ở nhiệt độ -70oC trong ít nhất 1 tháng).
- Ủ mẫu đồng nhất ở 15-30oC trong 5 phút, hút chuyển sang ống Epp 1,5 ml (thể tích mẫu đồng nhất đƣợc 0,3 ml).
- Thêm thêm 70 µl chloroform vào 0,3ml mẫu đồng nhất trong TRNzol. Ủ trong 3 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm mẫu ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút ở điều kiện 4oC. Hỗn hợp này phân tách thành 3 pha, trong đó pha trên cùng là pha nƣớc không màu và RNA tồn tại trong pha này. Hút dịch trong (pha nƣớc) sang ống mới.
- Thêm Isopropanol (có thể tích bằng thể tích hút đƣợc ở trên) vào pha nƣớc. Trộn kỹ bằng voltex và ủ ở nhiệt độ phòng trong 25 phút).
- Ly tâm lạnh ở tốc độ 12000 vòng/phút, trong 10 phút, ở điều kiện 4oC. Hút bỏ dịch nổi, tủa thu đƣợc dƣới đáy ống là RNA. RNA thƣờng khơng nhìn thấy trƣớc khi ly tâm và sau ly tâm sẽ hình thành một vệt trắng dạng gel ở dƣới đáy ống.
- Rửa tủa RNA với 700 ml ethanol 75%.
- Ly tâm ống ở tốc độ 10000 vòng/phút, trong 3 phút ở 4oC, loại bỏ ethanol. Ly tâm thêm 1 lần nữa ở tốc độ 10000 vòng/phút, trong 2 phút, ở 4oC dùng pipet loại hết dịch cịn sót dƣới đáy ống, cịn lại RNA.
- Làm khơ RNA viên trong 2-3 phút (khơng cho RNA khơ hồn tồn, vì điều đó có thể làm RNA bị phân rã).
Tạo cDNA
RNA sau khi đƣợc tách sẽ đƣợc đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch bằng máy Nano drop, sau đó sẽ đƣợc tạo thành cDNA bằng enzyme phiên mã ngƣợc Reverse Transcriptase.
Thành phần của phản ứng tạo cDNA:
- 10X M-MLV Reverse Transcriptase Buffer [500mM Tris HCl (pH 8.3), 30 mM MgCl2, 100mM DT, 750 mM KCl]: 2 μl
- RNA tổng số: 1 µg - Random hexamer: 1 μl - M- MLV Reverse Transcriptase: 1 μl - d NPT mixture (2mM mỗi loại): 2 µl - Nƣớc khử ion cho lên đến đủ : 20 μl Chu trình nhiệt cho tổng hợp cDNA:
25oC - 10 phút, 42oC - 60 phút, 95oC - 5 phút.
Bảo quản cDNA ở -20oC trong thời gian ngắn hoặc ở -80oC trong thời gian dài.
Real time PCR
Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự gia tăng lên về số lƣợng DNA tƣơng ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh số lƣợng sản phẩm đƣợc khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lƣợng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngƣỡng) của các mẫu là khác nhau.
Trong thí nghiệm này Real-time PCR đã thực hiện với 1μl cDNA mẫu trên máy ABI 7500 (Applied Biosystems, Mỹ). Sử dụng tín hiệu SYBER Green (Thermo Scientific, Mỹ). Các cặp mồi của gen CAR, CYP2B6 và β-actin ở ngƣời
Bảng 2.5. Trình tự của mồi cho Real-time PCR Mồi Trình tự mồi Mồi Trình tự mồi hCAR-F 5’ - TGGTACTGCAAGTCATCAAGT - 3’ hCAR-R 5’ - CTTCAATTGTGTAGCGAAGAG - 3’ hCYP2B6-F 5’ - AGACGCCTTCAATCCTGACC - 3’ hCYP2B6-R 5’ - CCTTCACCAAGACAAATCCGC - 3’ hβ-actin-F 5’ - TGACCCAGATCATGTTTGAGA - 3’ hβ-actin-R 5’ - TACGGCCAGAGGCGTACAGC - 3’ 2.3.4.3. Western Blot
Phƣơng pháp Western blot đƣợc thực hiện dựa theo phƣơng pháp của các cơng bố trƣớc [24, 46].
Mục đích
Trong nghiên cứu này kỹ thuật lai Western blot đƣợc thực hiện nhằm đánh giá mức độ biểu hiện protein CAR trong hai dòng tế bào HepG2 và dòng tế bào HEK293 sau khi đƣợc xử lý với MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng.
Nguyên lý:
Western Blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein (kháng nguyên - kháng thể). Protein kháng nguyên đƣợc phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.
Trong Western Blot, một hỗn hợp protein đƣợc phân tách bằng điện di SDS- PAGE. Các băng protein đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose và từng băng protein đƣợc phát hiện bằng cách ngâm màng PVDF với kháng thể đơn dịng và đa dịng có gắn enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm. Nếu protein quan tâm đƣợc kết hợp đặc hiệu bởi kháng thể đánh dấu, vị trí của nó có thể đƣợc phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm fim X quang.
Quy trình
Bước 1: Xử lý mẫu
Các tế bào HepG2 và HEK293 (3×105 tế bào/ml) đƣợc ni trong đĩa 6 giếng qua đêm, tiếp đó tế bào đƣợc ủ với dịch chiết MĐ hoặc dịch chiết GCL ở nồng độ xác định. Sau 24 giờ, tế bào đƣợc thu và đƣợc ly giải để tách protein tổng số bằng đệm RIPA (Thermor scientific), mẫu đƣợc xử lý với đệm Lamelli 5X.
Bước 2: Điện di trên gel
Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trên sự phân tách protein theo trọng lƣợng phân tử, trong hệ gel polyacrylamide.
Phƣơng pháp SDS-PAGE (điện di trên gel polyacrylamide biến tính) giữ các polypeptide ở trạng thái biến tính và mất đi cấu trúc bậc 2 và bậc 3 và do đó các protein đƣợc phân tách trên gel trong điện trƣờng.
Bảng 2.6. Thành phần của gel SDS-PAGE 10%
Thành phần Gel tách 10 % Gel cô 4% 30% polyacrylamide 1,7 ml 0,34 ml 1,5M Tris HCl, pH 8,8 1,3 ml - 1M Tris HCl, pH 6,8 - 0,25 ml 10% SDS 0,05 ml 0,02 ml APS 10% 0,05 ml 0,02 ml TEMED 0,002 0,002 ml H2O 1,8 ml 1,36 ml Tổng thể tích 5 ml 2 ml Hàm lƣợng protein tổng số cho vào mỗi giếng là 20 μg/giếng.
Chạy gel SDS-PAGE 10 %, điện áp 120V, 80mA (Chạy hệ trong đệm Runing Bufer ở điện áp 80V, 50 mA trong vịng 20 phút, sau đó chạy hệ ở 120V,
150 mA đến khi marker chạy gần hết gel tách - tùy thuộc vào khích thƣớc của protein đích mà ta chọn thời điểm dừng cho phù hợp).
Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai
Sau khi chạy điện di SDS-PAGE 15%, tiến hành chuyển lên màng Hybond-P