CHƢƠNG 2 : VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.4. Đánh giá ảnh hƣởng của dịch chiết mƣớp đắng và giảo cổ lam lên biểu hiện
hiện của gen CAR và gen CYP2B6
2.3.4.1 Xử lý tế bào với các dịch chiết mƣớp đắng, giảo cổ lam và hóa chất kiểm chứng
Các tế bào HepG2 và HEK293 (3 × 105 tế bào/ml) đƣợc nuôi cấy vào các giếng của đĩa 6 giếng qua đêm, sẽ đƣợc thay mơi trƣờng khơng có huyết thanh để các tế bào ngừng sinh trƣởng và dễ dàng hấp thụ các chất có trong mơi trƣờng. Bổ sung các dịch chiết MĐ hoặc GCL theo các nồng độ và hóa chất kiểm chứng nhƣ sau:
- Thí nghiệm 1: đối chứng với dung mơi DMSO
- Thí nghiệm 2: kiểm chứng phƣơng pháp, dựa trên các nghiên cứu trƣớc kia về tác động của CITCO hoạt hóa hoạt tính của CAR với nồng độ 1 μM [33] và PK11195 ức chế hoạt tính của CAR với nồng độ 2,5 μM [18].
- Thí nghiệm 3: Thử dịch chiết đơn của từng loại MĐ và GCL. Các dịch chiết MĐ và GCL đƣợc chuẩn bị với dải nồng độ dựa trên giá trị IC50 thu đƣợc ở thí nghiệm độc tính, để sàng lọc mức độ ảnh hƣởng, sau đó thiết kế lại dải nồng độ của dịch chiết có khả năng ảnh hƣởng tới mức độ biểu hiện của gen CAR và gen CYP2B6 tham gia vào quá trình giải độc trong tế bào.
- Các dịch chiết và hóa chất đƣợc ủ với tế bào thử nghiệm sau 24h trong điều kiện nuôi cấy tế bào (37oC và 5% CO2), sau đó thu tế bào và chuẩn bị cho phân tích biểu hiện mARN hay protein của gen CAR và CYP2B6.
2.3.4.2. Thực hiện phản ứng qRT- PCR
Mục đích:
Trong nghiên cứu này, Real-time PCR đƣợc thực hiện với mẫu cDNA (đƣợc tạo ra từ phản ứng RT) nhằm định lƣợng tƣơng đối số bản phiên mã của các gen
CAR (mã hóa cho protein CAR là thụ thể nhân tế bào điều chỉnh các gen đích tham
gia vào q trình giải độc cho cơ thể) và gen CYP2B6 là gen đích của thụ thể CAR (gen CYP2B6 mã hóa cho enzyme tham gia vào quá trình giải độc pha I). Qua đó sẽ đánh giá đƣợc mức độ biểu hiện mARN của các gen này sau khi xử lý với dịch chiết MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng.
Tách RNA tổng số bằng dung dịch TRNzol (Tách RNA theo khuyến cáo của nhà sản xuất (TRIzol RNA Isolation Reagents, Thermo Fisher Scientific)
Các tế bào HepG2 và HEK293 đã đƣợc ủ với MĐ, GCL, DMSO, CITCO, PK11195 với nồng độ nhất định (nồng độ đƣợc thiết kế dựa trên sau khi đã đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ và GCL trên hai dòng tế bào HepG2 và HEK293).
Nguyên lý tách chiết RNA
- Các phân tử RNA thƣờng không bền, dễ bị phân hủy bởi Rnase. Bởi vậy, việc tách RNA đòi hỏi nhiều biện pháp thận trọng để tránh mọi tạp nhiễm bởi các RNase từ môi trƣờng thao tác trong điều kiện vô trùng, mọi dụng cụ hóa chất đều đƣợc khử trùng bằng nhiệt.
- Để thu nhận RNA tinh sạch, ngƣời ta cần loại các thành phần tạp nhiễm, đặc biệt là protein. Sự tách chiết dựa trên nguyên tắc hòa tan khác nhau của các phân tử khác nhau (nucleic acid, protein) trong 2 pha khơng tan (phenol, chloroform/nƣớc).
Quy trình
- Đồng nhất mẫu: Mẫu tế bào sau khi đƣợc ủ với MĐ, GCL, DMSO, CITCO, PK11195 sẽ đƣợc đồng nhất với dung dịch TRNzol (sau khi đồng nhất trong TRNzol có thể đƣợc lƣu giữ ở nhiệt độ -70oC trong ít nhất 1 tháng).
- Ủ mẫu đồng nhất ở 15-30oC trong 5 phút, hút chuyển sang ống Epp 1,5 ml (thể tích mẫu đồng nhất đƣợc 0,3 ml).
- Thêm thêm 70 µl chloroform vào 0,3ml mẫu đồng nhất trong TRNzol. Ủ trong 3 phút ở nhiệt độ phòng.
- Ly tâm mẫu ở tốc độ 12000 vòng/phút trong 10 phút ở điều kiện 4oC. Hỗn hợp này phân tách thành 3 pha, trong đó pha trên cùng là pha nƣớc khơng màu và RNA tồn tại trong pha này. Hút dịch trong (pha nƣớc) sang ống mới.
- Thêm Isopropanol (có thể tích bằng thể tích hút đƣợc ở trên) vào pha nƣớc. Trộn kỹ bằng voltex và ủ ở nhiệt độ phòng trong 25 phút).
- Ly tâm lạnh ở tốc độ 12000 vòng/phút, trong 10 phút, ở điều kiện 4oC. Hút bỏ dịch nổi, tủa thu đƣợc dƣới đáy ống là RNA. RNA thƣờng khơng nhìn thấy trƣớc khi ly tâm và sau ly tâm sẽ hình thành một vệt trắng dạng gel ở dƣới đáy ống.
- Rửa tủa RNA với 700 ml ethanol 75%.
- Ly tâm ống ở tốc độ 10000 vòng/phút, trong 3 phút ở 4oC, loại bỏ ethanol. Ly tâm thêm 1 lần nữa ở tốc độ 10000 vòng/phút, trong 2 phút, ở 4oC dùng pipet loại hết dịch cịn sót dƣới đáy ống, cịn lại RNA.
- Làm khơ RNA viên trong 2-3 phút (khơng cho RNA khơ hồn tồn, vì điều đó có thể làm RNA bị phân rã).
Tạo cDNA
RNA sau khi đƣợc tách sẽ đƣợc đo nồng độ và kiểm tra độ tinh sạch bằng máy Nano drop, sau đó sẽ đƣợc tạo thành cDNA bằng enzyme phiên mã ngƣợc Reverse Transcriptase.
Thành phần của phản ứng tạo cDNA:
- 10X M-MLV Reverse Transcriptase Buffer [500mM Tris HCl (pH 8.3), 30 mM MgCl2, 100mM DT, 750 mM KCl]: 2 μl
- RNA tổng số: 1 µg - Random hexamer: 1 μl - M- MLV Reverse Transcriptase: 1 μl - d NPT mixture (2mM mỗi loại): 2 µl - Nƣớc khử ion cho lên đến đủ : 20 μl Chu trình nhiệt cho tổng hợp cDNA:
25oC - 10 phút, 42oC - 60 phút, 95oC - 5 phút.
Bảo quản cDNA ở -20oC trong thời gian ngắn hoặc ở -80oC trong thời gian dài.
Real time PCR
Kỹ thuật real-time PCR cho phép phát hiện và định lƣợng sản phẩm khuếch đại khi tiến trình phản ứng đang diễn ra dựa trên cơ sở phản ứng huỳnh quang, trong đó sự gia tăng lên về số lƣợng DNA tƣơng ứng với sự tăng lên của tín hiệu huỳnh quang. Tín hiệu huỳnh quang đo đƣợc phản ánh số lƣợng sản phẩm đƣợc khuếch đại trong mỗi chu kỳ. Tùy thuộc vào số lƣợng bản DNA đích ban đầu có trong ống phản ứng mà giá trị Ct (chu kỳ ngƣỡng) của các mẫu là khác nhau.
Trong thí nghiệm này Real-time PCR đã thực hiện với 1μl cDNA mẫu trên máy ABI 7500 (Applied Biosystems, Mỹ). Sử dụng tín hiệu SYBER Green (Thermo Scientific, Mỹ). Các cặp mồi của gen CAR, CYP2B6 và β-actin ở ngƣời
Bảng 2.5. Trình tự của mồi cho Real-time PCR Mồi Trình tự mồi Mồi Trình tự mồi hCAR-F 5’ - TGGTACTGCAAGTCATCAAGT - 3’ hCAR-R 5’ - CTTCAATTGTGTAGCGAAGAG - 3’ hCYP2B6-F 5’ - AGACGCCTTCAATCCTGACC - 3’ hCYP2B6-R 5’ - CCTTCACCAAGACAAATCCGC - 3’ hβ-actin-F 5’ - TGACCCAGATCATGTTTGAGA - 3’ hβ-actin-R 5’ - TACGGCCAGAGGCGTACAGC - 3’ 2.3.4.3. Western Blot
Phƣơng pháp Western blot đƣợc thực hiện dựa theo phƣơng pháp của các công bố trƣớc [24, 46].
Mục đích
Trong nghiên cứu này kỹ thuật lai Western blot đƣợc thực hiện nhằm đánh giá mức độ biểu hiện protein CAR trong hai dòng tế bào HepG2 và dòng tế bào HEK293 sau khi đƣợc xử lý với MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng.
Nguyên lý:
Western Blot là kỹ thuật lai giữa protein với protein (kháng nguyên - kháng thể). Protein kháng nguyên đƣợc phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang.
Trong Western Blot, một hỗn hợp protein đƣợc phân tách bằng điện di SDS- PAGE. Các băng protein đƣợc chuyển lên màng nitrocellulose và từng băng protein đƣợc phát hiện bằng cách ngâm màng PVDF với kháng thể đơn dịng và đa dịng có gắn enzyme hoặc đánh dấu phóng xạ đặc hiệu cho protein quan tâm. Nếu protein quan tâm đƣợc kết hợp đặc hiệu bởi kháng thể đánh dấu, vị trí của nó có thể đƣợc phát hiện bằng cách chụp màng lên tấm fim X quang.
Quy trình
Bước 1: Xử lý mẫu
Các tế bào HepG2 và HEK293 (3×105 tế bào/ml) đƣợc ni trong đĩa 6 giếng qua đêm, tiếp đó tế bào đƣợc ủ với dịch chiết MĐ hoặc dịch chiết GCL ở nồng độ xác định. Sau 24 giờ, tế bào đƣợc thu và đƣợc ly giải để tách protein tổng số bằng đệm RIPA (Thermor scientific), mẫu đƣợc xử lý với đệm Lamelli 5X.
Bước 2: Điện di trên gel
Điện di trên gel để phân tách các protein trong mẫu. Sự phân tách này của protein dựa trên sự phân tách protein theo trọng lƣợng phân tử, trong hệ gel polyacrylamide.
Phƣơng pháp SDS-PAGE (điện di trên gel polyacrylamide biến tính) giữ các polypeptide ở trạng thái biến tính và mất đi cấu trúc bậc 2 và bậc 3 và do đó các protein đƣợc phân tách trên gel trong điện trƣờng.
Bảng 2.6. Thành phần của gel SDS-PAGE 10%
Thành phần Gel tách 10 % Gel cô 4% 30% polyacrylamide 1,7 ml 0,34 ml 1,5M Tris HCl, pH 8,8 1,3 ml - 1M Tris HCl, pH 6,8 - 0,25 ml 10% SDS 0,05 ml 0,02 ml APS 10% 0,05 ml 0,02 ml TEMED 0,002 0,002 ml H2O 1,8 ml 1,36 ml Tổng thể tích 5 ml 2 ml Hàm lƣợng protein tổng số cho vào mỗi giếng là 20 μg/giếng.
Chạy gel SDS-PAGE 10 %, điện áp 120V, 80mA (Chạy hệ trong đệm Runing Bufer ở điện áp 80V, 50 mA trong vịng 20 phút, sau đó chạy hệ ở 120V,
150 mA đến khi marker chạy gần hết gel tách - tùy thuộc vào khích thƣớc của protein đích mà ta chọn thời điểm dừng cho phù hợp).
Bước 3: Chuyển protein gel lên màng lai
Sau khi chạy điện di SDS-PAGE 15%, tiến hành chuyển lên màng Hybond-P (GE Health Sciences, Mỹ). Các protein đƣợc di chuyển từ gel lên màng mà vẫn giữ nguyên đƣợc sự sắp xếp nhƣ trên bản gel. Sử dụng phƣơng pháp thẩm tách điện và dùng dòng điện 1 chiều để kéo protein từ gel lên màng, chạy hệ trong đệm chuyển ở điện áp 15V, 80mA trong 1 giờ 20 phút. Kết quả là protein sẽ đƣợc phơi ra trên lớp mỏng bề mặt để tiến hành xác định.
Bước 4: Xử lý màng lai (Blocking)
Do kháng thể và protein đích đều là protein, nên ta thực hiện bƣớc này để ngăn chặn liên kết giữa màng và kháng thể đƣợc sử dụng để xác định protein mục tiêu. Block màng bằng dung dịch protein loãng albumin huyết tƣơng bò 5 % (BSA 5%) trong TBS 1X, 0,1% Tween 20 trong 1 giờ sau đó rửa sạch màng bằng PBST.
Bước 5: Quá trình lai và phát hiện vị trí lai
- Lai với kháng thể sơ cấp: Protein trên màng đƣợc ủ với kháng thể đặc hiệu kháng hCAR hoặc β-actin (Cell Signaling, Mỹ), ủ qua đêm, lắc nhẹ ở 4oC. Sau khi ủ xong kháng thể sơ cấp, tiến hành rửa màng bằng dung dịch 1x T-PBS 3 lần, mỗi lần 5 phút.
- Gắn kháng thể thứ cấp: Ủ với kháng thể 2 là kháng thể thứ cấp anti rabit antibody có gắn HRP (horseradish peroxidase-conjugated antibody). Sau đó rửa màng bằng 1x T-PBS 3 lần, mỗi lần 10 phút. Màng sau đó đƣợc ủ với cơ chất ECL (NEB, Mỹ) và băng tín hiệu đƣợc nhận diện bằng tín hiệu X-quang trên phim.