Giá trị IC50 Đối tƣợng đánh giá độc tính Loại dịch chiết GCL Tác giả 40± 0,7 μg/ml HepG2 (tế bào ung thƣ gan) Tinh chất Dammarane saponins (namely
damulin C) Xiang-Lan Piao và cộng sự 2014 [68] 38 ± 0,5 μg/ml HepG2 (tế bào ung thƣ gan) Tinh chất Dammarane saponins (namely damulin D) 32 ± 1,24 μg/ml HepG2 (tế bào ung thƣ gan) Tinh chất gypenoside Shi L. và cộng sự (2015) [57] 1,6 μg/ml Hep3B (tế bào
ung thƣ gan) Carotenoid
Tsai YC và cộng sự (2010)
[60]
57,5 μg/ml Hep3B (tế bào
ung thƣ gan) Chlorophyll
Tsai YC và cộng sự (2010) [60] 31,62 ± 1,76 μg/ml HTC116 (tế bào ung thƣ ruột kết) Nonpolar Li Y và cộng sự (2016) [40] 35,48 ± 3,81 μg/ml LNCaP (tế bào ung thƣ tiền liệt
tuyến) 35,48 ± 3,81
μg/ml
MCF7 (tế bào ung thƣ vú)
Tƣơng tự nhƣ MĐ, cũng đã có các cơng bố về độc tính của GCL lên các dịng tế bào. Cơng bố của Xiang-lan Piao và công sự (2014) đã tiến hành nghiên cứu độc tính của tinh chất saponin có trong GCL 5 lá lên dịng tế bào ung thƣ gan (HepG2) giống nhƣ đề tài của chúng tôi. Kết quả cho thấy IC50 saponin (namely damulin C)= 40 ± 0,7 μg/ml, IC50 sapoin (namely damulin D)= 38 ± 0,7 μg/ml (bảng 3.4). Kết quả này thấp hơn so với đề tài của chúng tơi rất nhiều. Điều này đƣợc giải thích do nghiên cứu của họ sử dụng đánh giá độc tính của tinh chất cịn đề tài chúng tơi đánh giá độc tính của dịch chiết tổng số giống nhƣ việc hàng ngày ngƣời dân sử dụng GCL dƣới dạng trà uống.
Ngoài ra, cũng đã có nhiều cơng bố khác về độc tính của dịch chiết GCL đƣợc thể hiện ở bảng 3.4 cho thấy hầu hết tất cả các công bố đều tập trung vào nghiên cứu độc tính của tinh chất trong GCL. Công bố của Shi L. và cộng sự (2015) nghiên cứu độc tính của tinh chất gypenoside trên dòng tế bào HepG2 kết quả thu đƣợc giá trị IC50 = 32 μg/ml, hoặc công bố của Tsai YC và cơng sự (2010) đánh giá độc tính của Carotenoid và Chlorophyll trên dịng tế bào ung thƣ gan Hep3B cũng cho giá trị IC50 tƣơng đối thấp (IC50 (Carotenoid)= 1,6 μg/ml, IC50 (cholorophyll)= 1,6 μg/ml). Tất các cơng bố này đều có giá trị IC50 là thấp hơn so với đề tài của chúng tôi. Điều này cũng rất phù hợp với các phân tích ở trên, độc tính đƣợc thể hiện theo xu hƣớng tinh chất độc hơn so với dịch chiết tổng số.
So sánh độc tính của dịch chiết mướp đắng và giảo cổ lam
Hình 3.6. Độc tínhcủa hai dịch chiết mướp đắng và giảo cổ lam trên 02 dòng tế bàoHepG2 và HEK293
Giá trị IC50 của dịch chiết GCL cao hơn so với giá trị IC50 của dịch chiết MĐ trên cả hai dịng tế bào HepG2 và HEK293 (hình 3.6). Do đó độc tính của dịch chiết MĐ cao hơn nhiều so với GCL. Do vậy nếu đƣợc khuyến cáo sử dụng làm dƣợc liệu trong hỗ trợ điều trị ung thƣ thì MĐ nên đƣợc lựa chọn. Kết quả này cũng cho thấy dòng tế bào HEK293 nhạy cảm hơn với cả hai loại dịch chiết so với dòng tế bào HepG2.
Chƣa có cơng bố nào so sánh về độc tính của hai dịch chiết MĐ và GCL. Nhƣng kết quả này rất phù hợp với sự tổng hợp tài liệu của chúng tôi về tác dụng phụ của hai lồi thảo dƣợc này. Các cơng bố chủ yếu tập trung vào độc tính và tác dụng phụ của MĐ. Kinh nghiệm dân gian cũng nói rất nhiều về tác dụng phụ của việc sử dụng quá mức đối với MĐ nhƣ tiêu chảy, sốt cao, hôn mê, sảy thai,… Còn tác dụng phụ của việc sử dụng GCL thì rất ít các tài liệu nhắc đến. Vậy độc tính của MĐ cao hơn so với GCL đƣợc chỉ ra trong nghiên cứu này là hoàn toàn phù hợp với thực tế.
Ngồi các cơng bố về độc tính của MĐ và GCL thì cịn có các cơng bố về điều tra độc tính của các lồi thực vật khác. Điển hình nhƣ một nghiên cứu gần đây của Trần Thu Trang và cộng sự [8], khi khảo sát hoạt tính sinh học từ rễ tơ và rễ tự nhiên của cây bá bệnh. Loại thảo dƣợc này cũng có một số tác dụng dƣợc lý tƣơng tự với MĐ và GCL nhƣ điều trị bệnh tiểu đƣờng, kháng viêm, ung thƣ… Khi thử độc tính từ rễ tơ và rễ tự nhiên của cây bá bệnh trên dòng tế bào ung thƣ gan HepG2 đã cho kết quả: IC50 rễ tự nhiên = 63,8 μg/ml, IC50 rễ tơ = 77,4 μg/ml. Các giá trị IC50 của
rễ cây bá bệnh thấp hơn so với kết quả đề tài của chúng tơi có giá trị IC50 MĐ = 166,2 μg/ml và IC50 GCL = 378,7 μg/ml. Mặt khác nó cịn cho thấy dịch chiết MĐ và GCL thể hiện giá trị IC50 là tƣơng đối cao vì vậy hai loại dịch chiết MĐ và GCL ít gây độc cho cơ thể hơn so với một số loài thực vật khác
3.3. Biểu hiện của các gen tham gia vào quá trình giải độc khi đáp ứng với dịch chiết mƣớp đắng và giảo cổ lam chiết mƣớp đắng và giảo cổ lam
3.3.1. Biểu hiện của gen CAR khi đáp ứng với dịch chiết mƣớp đắng và giảo cổ lam lam
CAR đƣợc biết đến là thụ thể có vai trị cảm ứng với các chất ngoại lai và tham gia vào quá trình giải độc của tế bào. Do vậy nghiên cứu này đã đánh giá sự thay đổi về mức độ biểu hiện và hoạt tính của gen CAR khi xử lý với dịch chiết MĐ và GCL. CITCO (chất hoạt hoá CAR) và PK11195 (chất ức chế CAR) đã đƣợc sử dụng để kiểm tra mức độ thay đổi trong hoạt tính của gen CAR. Kết quả biểu hiện gen CAR đƣợc thể hiện ở hình 3.7.
Hình 3.7. Mức độ biểu hiện mARN của gen CAR khi đáp ứng với dịch chiết mướp đắng và giảo cổ lam trên dòng tế bào HepG2 (A) và HEK293 (B)
Hình 3.7 cho thấy mức độ biểu hiện mARN của gen CAR đã đƣợc tăng lên
khi xử lý với CITCO (6,87 lần đối với tế bào HepG2 và 5,86 lần đối với tế bào HEK293). Mức độ biểu hiện của gen CAR đã bị ức chế khi xử lý với PK11195
(giảm 1,6 lần đối với tế bào HepG2 và giảm 1,4 lần đối với tế bào HEK293), điều này phù hợp với các cơng bố trƣớc về vai trị của PK11195 và CITCO [18, 33].
Khi xử lý với dịch chiết MĐ (10 μg/ml, 50 μg/ml) mức độ biểu hiện mARN gen CAR trên dòng tế bào HepG2 tăng lên rất cao (6,2 và 15,3 lần) (Hình 3.7A).
Trong khi đó mức biểu hiện của gen này trên dịng HEK293 hầu nhƣ khơng thay đổi (tƣơng tự mẫu đối chứng khi ủ với DMSO) (Hình 3.7B). Tƣơng tự nhƣ khi xử lý với dịch chiết MĐ, mức độ biểu hiện của gen CAR trong tế bào HepG2 cũng tăng
lên phụ thuộc vào nồng độ dịch chiết GCL. Mức độ biểu hiện mRNA gen CAR trên dòng HepG2 đã tăng lên lần lƣợt là 13,9 và 26,8 lần khi xử lý với dịch chiết GCL tại nồng độ rất thấp tƣơng ứng là 1 μg/ml và 5 μg/ml so với đối chứng. Mức độ biểu hiện của gen CAR trên dòng tế bào HEK293 khi xử lý với dịch chiết GCL tại nồng độ 25 μg/ml đã tăng lên 3,96 lần so với đối chứng. Tuy nhiên mức độ biểu hiện này
lại bị giảm đi khi tăng nồng độ GCL lên nồng độ cao hơn (50 μg/ml). Mặc dù vậy mức độ biểu hiện này vẫn cao hơn đối chứng 2,3 lần. Kết quả cho thấy MĐ và GCL làm tăng mạnh mẽ mức độ biểu hiện gen CAR. Kết quả phân tích cho thấy GCL
kích hoạt gen CAR tốt hơn so với MĐ.
Thụ thể CAR hoạt động nhƣ một cảm biến với hóa chất ngoại lai, có vai trị trong quá trình giải độc cho cơ thể, bên cạnh đó CAR cũng điều chỉnh các chức năng gan khác nhau để kiểm sốt sinh lý và chuyển hóa năng lƣợng, insulin,…[48]. Sự kích hoạt CAR có tác dụng hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đƣờng cũng đã đƣợc nhóm nghiên cứu cơng bố khi xử lý tế bào với dịch chiết GCL. Kết quả nghiên cứu này cho thấy trong hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đƣờng nên sử dụng dịch chiết GCL sẽ vừa ít độc lại vừa kích hoạt đƣợc biểu hiện của gen CAR cao hơn so với MĐ.
3.3.2. Biểu hiện của protein CAR khi đáp ứng với dịch chiết mƣớp đắng và giảo cổ lam giảo cổ lam
Protein CAR có vai trị kích hoạt các gen tham gia vào q trình giải độc cho cơ thể. Vì vậy đánh giá đáp ứng biểu hiện protein CAR với dịch chiết MĐ và GCL góp phần làm sáng tỏ vai trị của thụ thể này trong quá trình giải độc. Kết quả biểu hiện protein CAR đƣợc thể hiện ở hình 3.8.
HepG2 Hek293 h β -a ctin DM S O P K1 11 9 2 .5 µ M CICT O 1 µ M M Đ 2 5 µg/ml GCL 1 µ g/ml h CAR kDa 55 40 45 DM S O P K1 11 9 2 .5 µ M CICT O 1 µ M M Đ 5 0 µ g/ml GCL 2 5 µ g/ml 55 40 45 h β -a ctin h CAR kDa
Hình 3.8. Mức độ biểu hiện protein CAR khi đáp ứng với dịch chiết mướp đắng và giảo cổ lam trên 02 dòng tế bào HepG2 và HEK293 bằng kỹ thuật Western bot
Nhƣ mong đợi, mức độ biểu hiện của protein CAR trong dòng tế bào gan HepG2 cao hơn dịng tế bào thận HEK293 nhƣ đã cơng bố trƣớc đây bởi Baes và cộng sự (1994). Đối với tế bào HepG2, biểu hiện của protein CAR đã tăng lên khi xử lý tế bào với chất hoạt hóa CITCO và giảm đi khi xử lý với chất ức chế PK1119 so với đối chứng nền là dung môi DMSO. Đồng thời việc xử lý tế bào HEPG2 với dịch chiết tổng số MĐ (nồng độ 25 µg/ml) và giảo cổ lam (nồng độ 1 µg/ml) cũng làm tăng cƣờng mức độ biểu hiện của CAR. Trong khi đó dịng tế bào HEK293 có mức độ biểu hiện protein CAR thấp, sự biểu hiện của protein CAR bị ảnh hƣởng không đáng kể bởi các chất kiểm chứng và dịch chiết thực vật. Kết quả này cũng phù hợp với kết quả biểu hiện mARN.
3.3.3. Biểu hiện của gen CYP2B6 khi đáp ứng với dịch chiết mƣớp đắng và giảo cổ lam cổ lam
Gen CYP2B6 đƣợc biết đến là gen mã hóa cho enzyme tham gia vào q trình giải độc pha I của cơ thể. CYP2B6 là gen đích của thụ thể CAR [34] đã đƣợc sử dụng nhƣ dấu ấn nhận diện sự hoạt hóa CAR bởi các chất trong nghiên cứu này. Kết quả biểu hiện của gen CYP2B6 khi đáp ứng với dịch chiết MĐ và GCL đƣợc thể hiện ở hình 3.9.
Hình 3.9. Mức độ biểu hiện mARN của gen CYP2B6 khi đáp ứng với dịch chiết mướp đắng và giảo cổ lam trên dòng tế bào HepG2 (A) và HEK293 (B)
Đúng nhƣ mong đợi, sự biểu hiện của gen CYP2B6 (gen đích của thụ thể
CAR) đã giảm khi xử lý tế bào với chất ức chế PK1119 khoảng 4,4 lầnvà mức độ biểu hiện của gen này đã đƣợc tăng lên khi xử lý với chất hoạt hóa CITCO khoảng
1,78 lần ở HepG2 (Hình 3.9A). Các kết quả này là phù hợp với các nghiên cứu trƣớc [18, 33].
Mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2B6 không thay đổi khi xử lý với dịch chiết MĐ ở nồng độ 10 µg/ml, song mức biểu hiện gen này tăng lên đáng kể (3,86 lần) ở nồng độ 50 µg/ml trên dịng HepG2 (Hình 3.9A). Dƣới sự có mặt của dịch chiết GCL (1 µg/ml và 5 µg/ml), mức độ biểu hiện mRNA của gen CYP2B6 tăng
lên đáng kể (3,8 và 2,6 lần) trên dịng HepG2. Trong khi đó, mức độ biểu hiện của gen này trong dòng tế bào HEK293 dƣới tác động của tất cả các chất thử nghiệm đều khơng bị ảnh hƣởng. Kết quả này có thể là do biểu hiện của protein CAR trong tế bào HEK293 là rất ít và khơng bị thay đổi khi xử lý với các chất thử nghiệm trên, thậm trí với nồng độ GCL cao gấp 25 lần so với nồng độ xử lý ở tế bào HepG2. Điều đó chứng tỏ rằng khi CAR có biểu hiện nhiều hơn sẽ có tác động rõ rệt lên các q trình phiên mã phụ thuộc vào nó.
KẾT LUẬN
1. Dịch chiết MĐ và GCL đã thể hiện độc tính trên 02 dịng tế bào HepG2 và HEK293.
- Cả hai dịch chiết MĐ và GCL đã gây ra sự biến đổi hình thái của các dịng tế bào từ hiện tƣợng co màng, tế bào bị tách khỏi bề mặt đĩa ni cấy và chết.
- Độc tính của dịch chiết MĐ cao hơn so với GCL đối với cả hai dòng tế bào và tế bào HEK293 nhạy cảm hơn với cả hai loại dịch chiết so với tế bào HepG2, thể hiện qua các giá trị IC50.
+ Giá trị IC50 của MĐ trên dòng tế bào HepG2 là 166,2 μg/ml + Giá trị IC50 của MĐ trên dòng tế bào HEK293 là 108,9 μg/ml + Giá trị IC50 của GCL trên dòng tế bào HepG2 là 378,7 μg/ml + Giá trị IC50 của GCL trên dòng tế bào HEK293 là 228,9 μg/ml.
2. Đáp ứng của gen CAR và gen CYP2B6 tham gia vào quá trình giải độc cho tế bào đã thay đổi khi xử lý với dịch chiết MĐ và GCL. Mặc dù xử lý ở nồng độ thấp hơn nhƣng dịch chiết GCL đã kích hoạt gen CAR tốt hơn so với dịch chiết MĐ.
- Đối với dòng tế bào HepG2 khi xử lý với dịch chiết GCL ở nồng độ 5 μg/ml thì mức độ biểu hiện mARN của gen CAR đã tăng rất cao (26,8 lần), khi xử lý với dịch chiết MĐ ở nồng độ 50 μg/ml mức độc biểu hiện mARN của gen CAR đã tăng 14 lần.
- Đối với dòng tế bào HEK293 khi xử lý với dịch chiết GCL biểu hiện của gen CAR tăng 3,8 lần trong khi đó xử lý tế bào HEK293 với dịch chiết MĐ biểu
KIẾN NGHỊ
1. Tiếp tục đánh giá độc tính của MĐ và GCL trong các trƣờng hợp sau: - Ở các vùng có điều kiện sinh thái khác nhau.
- Trên các bộ phận thực vật khác nhau.
- Lên các đối tƣợng thử nghiệm độc tính khác.
→ Để xây dựng cơ sở dữ liệu về độc tính của hai lồi MĐ và GCL cho các
ứng dụng trong lĩnh vực y, dƣợc và đời sống thực tiễn.
2. Phân lập và đánh giá độc tính của một số chất đặc trƣng trong thành phần của dịch chiết MĐ và GCL đã đƣợc công bố về khả năng kháng ung thƣ và các tác dụng dƣợc lý đối với các bệnh khác.
3. Đánh giá thêm biểu hiện của các gen khác tham gia vào quá trình giải độc khi xử lý với dịch chiết MĐ và GCL làm tiền đề cho các ứng dụng cho các thí nghiệm đánh giá dƣợc tính của MĐ và GCL trong điều trị một số bệnh nhƣ ung thƣ và tiểu đƣờng.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
TIẾNG VIỆT
1. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chƣơng, Nguyễn Thƣợng Dong, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Ngọc Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Nhu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2006), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Tập II, Nxb Khoa học và kĩ thuật, tr. 335-341, tr. 792-793.
2. Võ Văn Chi (1997), Từ điển cây thuốc Việt Nam, tập 2, tr 308 - 309. 3. Võ Văn Chi (1997), Từ điển thực vật thông dụng, tập 2, tr 1322, 1323.
4. Võ Văn Chi (2012), Từ điển cây thuốc Việt Nam, Tập II, Nxb Y học Hà Nội, tr. 185-186.
5. Phạm Hoàng Hộ (1999), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, quyển I, tr 563-575.
6. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nhà xuất bản Khoa Học và Kĩ Thuật, Hà Nội, trang 335-337.
7. Thi Xuân Mi (2002), Thảo dƣợc chữa bệnh (Nguyễn Thanh Tùng dịch, BS Ngọc Tám hiệu đính), Nhà xuất bản Thanh Hóa, trang 62.
8. Trần Thu Trang, Phạm Bích Ngọc, Chu Nhật Huy, Hoàng Thị Thu Hằng, Nguyễn Trung Nam, Chu Hoàng Hà (2017), "Khảo sát một số hoạt tính sinh học trong cao chiết methanol từ rễ tơ và rễ tự nhiên cây bá bệnh (Eurycoma longifolia Jack)", Tạp chí Khoa học ĐHQG Hà Nội: Khoa học tự nhiên và
Công nghệ, tập 33, số 2, tr. 67-73.
TIẾNG ANH
9. Abd El Sattar El Batran S, El-Gengaihi SE, El Shabrawy OA. (2006), “Some toxicological studies of momordica charantia, L. on albino rats in normal and alloxan diabetic rats”, J. Ethnopharmacology, 108, pp. 236-242. 10. Adewale, O.O.; Oduyemi, O.I.; Ayokunle, O. (2014), “Oral administration of leaf