Tế bào ở trạng thái bình thƣờng (hình bên trái) và tế bào đang đi vào quá trình apotosis (hình bên phải) [20]
Kết quả cho thấy sự biến đổi về hình thái trong hai dịng tế bào HepG2 và HEK293 khi đáp ứng với dịch chiết MĐ khá giống sự biến đổi về hình của tế bào u não chuột trong quá trình apoptosis. Quan sát thấy các tế bào co trịn, sau đó co cụm lại và gây chết tế bào. Nhƣ vậy có thể thấy khi xử lý với dịch chiết MĐ ở nồng độ cao (từ 121,8 μg/ml) thì cả tế bào ung thƣ và tế bào thƣờng đều có hiện tƣợng chết. Sự chết tế bào này có thể đƣợc dự đoán là hiện tƣợng tế bào trải qua con đƣờng apoptosis. Tuy nhiên, để khẳng định chắc chắn sự chết của các tế bào có thực sự là hiện tƣợng apoptosis hay khơng thì các nghiên cứu phân tử khác chứng minh sự có mặt các dấu ấn phân tử của sự chết apotosis dƣới tác động của dịch chiết MĐ cần phải đƣợc tiến hành.
Ảnh hưởng của dịch chiết mướp đắng lên sự sinh trưởng của dòng tế bào HepG2 và HEK293.
Để đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ trên các dòng tế bào HepG2 và HEK293, sự sinh trƣởng của các tế bào dƣới ảnh hƣởng của dịch chiết MĐ đã đƣợc xác định bằng thử nghiệm MTS ở các nồng độ dịch chiết khác nhau. Khả năng sống của các tế bào sau 48 giờ ủ với dịch chiết đã đƣợc sử dụng để xác định giá trị IC50
làm cơ sở cho việc đánh giá độc tính của dịch chiết MĐ với các dịng tế bào. Kết quả đƣợc thể hiện ở bảng 3.1 và hình 3.3.
Bảng 3.1. Độc tính của mướp đắng lên hai dịng tế bào HepG2 và HEK293
Nồng độ dịch chiết MĐ
(g/ml)
Khả năng sống sót của tế bào (%)± SEM, n=3
Giá trị IC50 (g/ml) HepG2 HEK293 HepG2 HEK293
7,6 86,43± 10,27 87,09± 3,46 166,2 108,9 15,2 86,54± 2,98 84,44± 3,16 30,4 86,25± 8,29 83,90± 5,56 60,9 80,27± 0,37 75,85± 0,27 121,8 78,39±1,51 39,75± 0,16 243,5 23,34± 0,87 37,08± 1,25 487,0 0,44± 0,14 0,97± 0,31
Dòng tế bào ung thƣ của ngƣời (HepG2) đƣợc chọn làm mơ hình nghiên cứu trong đề tài này do sự phổ biến của nhiều cái chết liên quan đến ung thƣ gan ở Việt Nam và trên toàn thể giới hiện nay, hơn nữa gan cũng là cơ quan tham gia chính vào quá trình giải độc cho cơ thể. Vì vậy sử dụng dịng tế HepG2 vừa đánh giá đƣợc độc tính của dịch chiết MĐ đối với cơ thể, lại vừa là một nhiệm vụ cấp bách để phát triển mơ hình thực nghiệm chống lại căn bệnh ung thƣ chết ngƣời này. Bên cạnh đó, dịng tế bào bình thƣờng HEK293 cũng đƣợc sử dụng để đánh giá nguy cơ ảnh hƣởng của dịch chiết MĐ đối với các tế bào thƣờng trong quá trình điều trị ung thƣ.
Bảng 3.1 và hình 3.3 cho thấy tại nồng độ 7,6 μg/ml khả năng tồn tại của tế bào đã giảm xuống 87- 86 % ở cả hai dòng tế bào. Tuy nhiên mức độ chết của mỗi dòng tế bào là khác nhau ở các nồng độ dịch chiết khác nhau. Đối với dòng tế bào HepG2, khơng có sự khác biệt đáng kể về khả năng sống ở trong khoảng nồng độ từ 7,6- 60,9 µg/ml (khả năng tồn tại của tế bào luôn giữ xấp xỉ khoảng 80-86 %). Tuy nhiên tỷ lệ sống của các tế bào này đã giảm xuống cịn 78,39% tại nồng độ 121,8 µg/ml và giảm mạnh ở nồng độ 243,5 µg/ml (tỷ lệ sống chỉ cịn 23,34%) và giảm hoàn toàn ở nồng độ 487,5 µg/ml (tỷ lệ sống chỉ cịn 0,44%). Trong khi đó, khả năng tồn tại của tế bào HEK293 không khác biệt nhiều khi xử lý tế bào tại các nồng độ từ 7,7-30,4 µg/ml. Tỷ lệ tế bào sống giảm xuống còn 75% tại nồng độ 60,9 µg/ml và giảm mạnh xuống còn 39,75% và 37,08% tại nồng độ 121,8 µg/ml và 243,5 µg/ml. Tỷ lệ sống sót giảm gần nhƣ hồn ở nồng độ cuối 487,0 µg/ml.
Nhƣ vậy sức sống tế bào sống gần nhƣ hết ở cả hai dòng tế bào HepG2 và HEK293 khi đáp ứng với nồng độ cao nhất của dịch chiết MĐ (487,0 µg/ml). Các kết quả thử đƣợc từ phép thử độc tính bằng thử nghiệm MTS là hoàn toàn phù hợp với các kết quả phân tích hình thái học ở trên.
Kết quả nghiên cứu cho thấy, dịch chiết MĐ đã thể hiện độc tính của nó trên tế bào ung thƣ gan HepG2 và tế bào thƣờng HEK293 với giá trị IC50 tƣơng ứng là 166,2 µg/ml và 108,9 µg/ml (bảng 3.1). Điều này đã chứng tỏ rằng tế bào HEK293 nhạy cảm hơn với dịch chiết tổng số MĐ so với dịng tế bào HepG2.
Đã có nhiều nghiên cứu về tác dụng khác của MĐ, đặc biệt là trong việc hỗ trợ điều trị bệnh tiểu đƣờng và mỡ máu [11, 70]. Nồng độ và liều lƣợng nhỏ hơn giá trị IC50 của mỗi dòng tế bào khi đáp ứng với dịch chiết MĐ trong đề tài này đƣợc sử dụng cho các thí nghiệm đánh giá ảnh hƣởng tiếp theo. Các kết quả về độc tính của dịch chiết MĐ có thể là cơ sở để giải thích về tác dụng phụ khi sử dụng MĐ làm thực phẩm [35].
Một số nghiên cứu trên thế giới tập trung vào độc tính của dịch chiết MĐ trong thí nghiệm in vitro với các dòng tế bào khác nhau hoặc trong thí nghiệm in vivo. Một nghiên cứu gần đây thu đƣợc giá trị IC50 là 0,77 µg/ ml của dịch chiết MĐ chống lại tế bào HepG2 [12] thấp hơn rất nhiều so với giá trị thu đƣợc trong nghiên cứu này (166,2 µg/ml). Sự khác biệt này có thể đƣợc giải thích là do sự khác nhau về nguồn gốc của MĐ (về điều kiện khí hậu và thổ nhƣỡng,…), khác nhau về bộ phận tách chiết MĐ (thịt quả hay toàn bộ quả,…), hay khác về quy trình thí nghiệm,… Nghiên cứu của chúng tơi sử dụng tồn bộ quả MĐ giống nhƣ việc tiêu thụ hàng ngày của ngƣời dân Việt Nam sử dụng làm trà phơi khơ để uống, có thể gây ra sự khác biệt đối với nghiên cứu của họ chỉ lấy phần thịt của quả MĐ từ Ả Rập. Giá trị IC50 của nhóm nghiên cứu trƣớc thấp hơn nghiên cứu này cũng có thể do sự khác biệt về thời gian thử nghiệm độc tính khi họ xác định khả năng sống của tế bào sau 72 giờ ủ với MĐ [12]. Cũng có một số các nghiên cứu khác về độc tính của MĐ đƣợc thể hiện ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Một số công bố về độc tính của dịch chiết mướp đắng Giá trị IC50 Thời gian phơi nhiễm Loại dịch chiết Đối tƣợng
đánh giá Nguồn gốc Tác giả
14,01μmol/l 48 giờ Tinh chất tripterpen Tế bào Hep3B (Ung thƣ gan) Trung Quốc Xiaojing Wang và cộng sự (2012) [69] 0,81 μg/ml 72 giờ Tổng số Tế bào HCT116 (Ung thƣ ruột kết) Ả rập Alshehri và cộng sự (2016) [12] 711,6 μg/ml 72 giờ Dịch chiết thô MiAPaC-2 (tế bào ung thƣ tuyến tụy) Đông Nam Á Rebecca A và cộng sự (2017) [54] 1475 μg/ml 48 giờ Dịch chiết thô 350,8 μg/ml 72 giờ Giàu Saponin 738 μg/ml 48 giờ Giàu saponin 508,91 g/ml 24 giờ Tổng số (lá, thân, rễ) Tế bào Hela (ung thƣ cổ tử cung) Thái Lan Duriya Fongmoon và cộng sự (2013) [25] 8,06 g/ml 24 giờ Tinh chất ascobic
1,07 μmol/l 48 giờ Tinh chất Tripterpen Tế bào A549 ( ung thƣ phổi) Trung quốc Xiaojing Wang và cộng sự
1,08 μmol/l 48 giờ Tinh chất tripterpen Tế bào A549 (Ung thƣ não) (2012) [69] 1,35 μg/ml 72 giờ Tổng số Tế bào MCF-7 (Tế bào ung thƣ vú) Ả Rập Alshehri (2016) [12] LC50 = 12,38 g/ml - Tinh chất Flavonoid từ quả MĐ
Tôm biển Bangladesd
RaShu Barua và cộng sự (2014) [53] LC50 = 4,04 g/ml - Tinh chất
Axit Gallic Tôm biển Bangladesd
Một nghiên cứu của Xiaojing Wang và cộng sự (2012), họ đánh giá độc tính của tinh chất saponin, đây là một trong những chất mang hoạt tính sinh học cao có trong thành phần của MĐ. Công bố thể hiện giá trị IC50 rất thấp đối với các dòng tế bào ung thƣ gan, ung thƣ phổi và ung thƣ não lần lƣợt là (14,01μmol/l; 1,07 μmol/l; và 1,08 μmol/l). Nghiên cứu này càng khẳng định tác dụng chống ung thƣ của dịch chiết MĐ. Nếu so sánh kết quả này với kết quả nghiên cứu trong đề tài của chúng tơi cũng là phù hợp vì đề tài của chúng tơi sử dụng dịch chiết tổng số từ MĐ cho thấy MĐ có độc tính là tƣơng đối cao lên dịng tế bào ung thƣ gan (HepG2) và dịng tế bào thận phơi ngƣời (HEK293).
Nghiên cứu khác của Rebecca A và cộng sự (2017) khi đánh giá độc tính của dịch chiết thơ và dịch chiết đã đƣợc làm giàu saponin có trong thành phần của MĐ đƣợc thu hái tại khu vực Đông Nam Á [54]. Nghiên cứu của họ đánh giá trên đối tƣợng là dòng tế bào ung thƣ tuyến tụy, bằng thử nghiệm CCK-8 trong vòng 72 giờ và 48 giờ. Kết quả thu đƣợc IC50(dịch chiết thô, 72 giờ)= 711,6 μg/ml, IC50(dịch chiết thô, 48 giờ)= 1475 μg/ml, IC50(dịch chiết giàu saponin, 72 giờ)= 350,8 μg/ml, IC50(dịch chiết giàu saponin, 48 giờ)= 738 μg/ml. Kết quả nghiên cứu của đề tài này thể hiện giá trị IC50 của dịch chiết MĐ là tƣơng đối cao so với các nghiên cứu của chúng tôi và các cơng bố đã phân
tích ở trên. Điều này cũng có thể đƣợc giải thích do họ sử dụng đối tƣợng thử nghiệm độc tính trên dịng tế bào khác (ung thƣ tuyến tụy) và nguồn gốc của MĐ đƣợc thu hái từ vùng có điều kiện sinh thái (khí hậu, thổ nhƣỡng,…) khác dẫn đến các kết quả là khác nhau. Kết quả nghiên cứu này còn cho thấy chiều hƣớng: Độc tính của chất thử nghiệm tăng khi thời gian phơi nhiễm với chất độc tăng và dịch chiết khi làm giàu saponin (tinh chất) có độc tính cao hơn so với dịch chiết thô. Vậy kết quả của nghiên cứu này cũng phù hợp khi so sánh kết quả nghiên cứu đề tài của chúng tôi với các nghiên cứu trƣớc nhƣ đã phân tích ở trên.
Ngồi các cơng bố thử nghiệm độc tính của MĐ trên các dịng tế bào cịn có các cơng bố thử nghiệm độc tính trên các đối tƣợng là sinh vật thủy sinh. Công bố của RaShu Barua và cộng sự (2014) đã tiến hành thử nghiệm độc tính của tinh chất Flavonoid và Axit Gallic có trong MĐ trên đối tƣợng là tơm biển [53]. Nghiên cứu này đã thu đƣợc kết quả LC50 (Flavonid) = 12,38 g/ml, LC50 (Axit Gallic) = 4,04 g/ml. Kết quả nghiên cứu này cho thấy MĐ cũng thể hiện độc tính cao đối với các sinh vật thủy sinh. Sau khi thu hoạch MĐ, các bộ phận khác của cây nhƣ lá, thân,… cũng rất có thể bị phân hủy vào mơi trƣờng nƣớc và gây độc cho hệ sinh thái thủy vực tại các khu vực có trồng MĐ. Do đó cần có những biện pháp giảm thiểu ảnh hƣởng độc tính của MĐ đến hệ sinh thái thủy vực.
Vậy khi so sánh các kết quả nghiên cứu về độc tính của MĐ của các cơng bố ở bảng 3.2 với kết quả nghiên cứu trong đề tài của chúng tôi, những kết quả này càng khẳng định rằng tính độc của các lồi thực vật lên các dòng tế bào (kể cả tế bào ung thƣ và tế bào thƣờng) khơng chỉ phụ thuộc vào từng lồi thực vật mà còn phụ thuộc vào nguồn gốc thực vật phân bố ở những vùng có điều kiện sinh thái khác nhau sẽ có độc tính khác nhau. Ngồi ra, độc tính cịn phụ thuộc vào loại dịch chiết (tinh chất hay tổng số), các bộ phận của thực vật và thời gian phơi nhiễm với các chất độc.
3.2.2. Độc tính của dịch chiết giảo cổ lam lên các dịng tế bào
Ảnh hưởng của dịch chiết giảo cổ lam lên hình thái tế bào
Cũng tƣơng tự nhƣ dịch chiết MĐ, sự thay đổi về hình thái tế bào chính là một tiêu chí quan trọng để đánh giá độc tính của dịch chiết GCL. Những thay đổi về hình thái của tế bào đƣợc quan sát sau khi ủ ở các nồng độ khác nhau của dịch chiết GCL (10, 20; 40, 80, 160, 320 và 640 μg/ml) với tế bào HEK293 và HepG2 (hình 3.4).
Nồng độ dịch chiết GCL (μg/ml)
Dòng tế bào HepG2 Dòng tế bào HEK 293
Control
20
40
160
320
640
Hình 3.4. Sự thay đổi về hình thái của 02 dịng tế bào khi đáp ứng với dịch chiết giảo cổ lam ở các nồng độ khác nhau
Sự biến đổi về hình thái tế bào của hai dòng tế bào HepG2 và HEK293 có mức độ khác biệt phụ thuộc vào nồng độ của dịch chiết GCL. Kết quả cho thấy dịch chiết GCL trong khoảng nồng độ 10- 80 µg/ml hầu nhƣ khơng ảnh hƣởng đến hình thái tế bào HepG2, chỉ khi đến nồng độ 160 µg/ml mới thấy có sự thay đổi nhẹ về hình thái tế bào (các tế bào có hiện tƣợng co lại). Sự thay đổi rõ rệt đã xuất hiện từ nồng độ 320 µg/ml trở lên. Tế bào HepG2 đã tròn ra căng phồng và giảm độ bám dính bề mặt. Trong khi đó, hình thái tế bào HEK293 có sự thay đổi ngay ở nồng độ thấp hơn (80 µg/ml) và thay đổi càng rõ rệt ở các nồng độ cao hơn. Các tế bào HEK293 có hiện tƣợng bị co màng và chết khi đáp ứng với dịch chiết GCL (tại các nồng độ từ 160-640 µg/ml). Cịn ở các nồng độ GCL thấp từ 10-40 µg/ml thì hình thái tế bào HEK293 khơng bị ảnh hƣởng.
Kết quả cho thấy về tiêu chí thay đổi hình thái tế bào khi đáp ứng với dịch chiết GCL cũng tƣơng tự nhƣ khi đáp ứng với dịch chiết MĐ thì dịng tế bào HEK293 cũng nhạy cảm hơn so với dòng tế bào HepG2.
Ảnh hưởng của dịch chiết GCL lên sự sinh trưởng của dòng tế bào HepG2 và HEK293.
Độc tính của dịch chiết GCL trên các dịng tế bào HepG2 và HEK293 đƣợc xác định thông qua tỷ lệ sống của tế bào và giá trị IC50 thể hiện ở bảng 3.3 và hình 3.5.
Bảng 3.3. Độc tính của giảo cổ lam lên hai dịng tế bào HepG2 và HEK293
Nồng độ dịch chiết giảo cổ lam
(g/ml)
Khả năng sống sót của tế bào (%)± SEM, n=3
Giá trị IC50 (g/ml) HepG2 HEK293 HepG2 HEK293
10 99,26 ± 1,61 91,38 ± 9.98 378,7 228,9 20 96,09 ± 2,05 84,70 ± 2,88 40 94,45 ± 2,63 84,03 ± 8,99 80 94,32 ± 2,02 81,77 ± 0,36 160 90,47 ± 6,55 78,02 ± 0,41 320 80,41 ± 2,02 33,00 ± 0,19 640 1,15 ± 0,57 0,04 ± 0,04
Hình 3.5. Đường cong đáp ứng của các dịng tế bào với dịch chiết giảo cổ lam
Kết quả bảng 3.3 và hình 3.5 cho thấy đối với dịng tế bào HepG2 khi xử lý với dịch chiết GCL ở nồng độ 10 µg/ml khơng ảnh hƣởng đến khả năng tồn tại của tế bào (tỷ lệ sống cịn 99,26%). Từ khoảng nồng độ 20-80 µg/ml khả năng sống của tế bào bị ảnh hƣởng rất ít (tỷ lệ sống khoảng 94-96 %). Tỷ lệ các tế bào chết đạt 10% tại nồng độ 160 µg/ml (tỷ lệ sống còn 90,47%). Tỷ lệ chết tế bào tăng lên 20% ở nồng độ 320 µg/ml và đạt cao nhất tới 98% ở nồng độ 640 µg/ml. Đối với dịng HEK293 đã bị ảnh hƣởng ngay từ nồng độ 10 µg/ml với tỷ lệ chết khoảng 9%. Tỷ lệ này tăng lên từ 15-22% tại các nồng độ từ 20-160 µg/ml. Khơng giống nhƣ tế bào HepG2 có tỷ lệ sống khoảng 80%, tỷ lệ sống của tế bào HEK293 đã giảm đột xuống cịn 33% ở nồng độ 320 µg/ml. Tỷ lệ sống của các tế bào HEK293 giảm hồn tồn ở nồng độ 640 µg/ml.
Vậy kết quả cho thấy, dịch chiết GCL gây độc mạnh hơn cho tế bào HEK293 so với tế bào HepG2 với giá trị IC50 tƣơng ứng là 228,9 µg/ml và 378,7 µg/ml. Kết quả này cho thấy tế bào thận lành tính HEK293 nhạy cảm với dịch chiết GCL hơn so với dòng tế bào ung thƣ gan HepG2.
Tƣơng tự nhƣ MĐ cũng có các cơng bố về độc tính của GCL đƣợc thể hiện ở bảng 3.4.
Bảng 3.4. Một số cơng bố về độc tính của dịch chiết giảo cổ lam
Giá trị IC50 Đối tƣợng đánh giá độc tính Loại dịch chiết GCL Tác giả 40± 0,7 μg/ml HepG2 (tế bào ung thƣ gan) Tinh chất Dammarane saponins (namely
damulin C) Xiang-Lan Piao và cộng sự 2014 [68] 38 ± 0,5 μg/ml HepG2 (tế bào ung thƣ gan) Tinh chất Dammarane saponins (namely damulin D) 32 ± 1,24 μg/ml HepG2 (tế bào ung thƣ gan) Tinh chất gypenoside