Tên Hãng sản xuất
Tủ hút Esco, Mỹ
Tủ ấm 5% CO2 Shel Lab, Mỹ Kính hiển vi soi ngƣợc Axiovert 40 CFL Carl Zeiss, Đức Kính hiển vi quang học Carl Zeiss, Đức Bể ổn nhiệt Gra Operation SS40-1 Đức
Máy votex WhirliMixer Anh
Máy li tâm lạnh 5415 R Eppendorf, Đức Máy li tâm Universal 320 Hettich, Pháp Microplate Reader Model 680 Bio-Rad, Nhật Bản
Nanodrop One Thermo Scientific, Mỹ Pipet aid Gilson, Pháp
Pipet man Gilson, Pháp Buồng đếm tế bào Thomas, Đức Tủ sấy mẫu Memmert, Đức Máy cô quay chân không Biobase, Trung Quốc Máy Real-time PCR 7500 Applied Biosystems, Mỹ
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Tách chiết dịch mƣớp đắng và giảo cổ lam
Quy trình tách chiết MĐ và GCL đƣợc thực hiện theo quy trình đã đƣợc cơng bố [52, 75] với một số điều kiện thay đổi.
- Đối với MĐ lấy phần quả, đối với GCL đƣợc lấy toàn bộ phần thân, cành và lá trên mặt đất vào mùa khô. Các bộ phận đó đƣợc rửa sạch và cắt nhỏ, sấy khô ở nhiệt độ 60oC, cho đến khối lƣợng không đổi bằng cách cân trọng lƣợng khô sau các thời gian khác nhau cho đến khi thấy trọng lƣợng không sai khác nhau.
- Cân 50 g MĐ và GCL khơ và rót vào 300 ml dung mơi chiết là methanol nồng độ 80%, ngâm trong lọ thủy tinh khoảng 2 giờ. Chiết bằng máy siêu âm ở nhiệt độ 40oC trong 30 phút. Thu dịch chiết và phần bã thô lại tiếp tục ngâm trong 100ml dung môi và siêu âm trong 15 phút, lặp lại bƣớc này một lần nữa.
- Toàn bộ dịch chiết thu đƣợc lọc qua màng lọc có kích thƣớc lỗ lọc 0,45 μm - Dịch lọc đƣợc cô quay chân không và cô bằng Nitơ để bay hết dung môi methanol.
- Xác định khối lƣợng cao khô thu đƣợc và hịa tan bằng dung mơi (DMSO) để đƣợc nồng độ cao nhất có thể.
Hình 2.3. Một số hình ảnh tách chiết mẫu mướp đắng và giảo cổ lam A: Chiết mẫu bằng siêu âm: Dịch chiết thu được trước cô quay B: Cô quay thu mẫu: Mẫu khô sau khi cô quay, MĐ (bên phải), GCL (bên trái)
2.3.2. Hoạt hóa và ni cấy tế bào
- Rã đông nhanh tế bào: Tế bào HepG2 và HEK293 đƣợc lấy ra khỏi bình nitơ lỏng đƣợc làm rã đông nhanh trong bể ổn nhiệt 37oC, sau đó đƣợc đƣa vào ống phalcon 15 ml đã chứa sẵn 5 ml môi trƣờng nuôi cấy tƣơng ứng của tế bào HepG2 và HEK293.
- Ly tâm 1500 vòng/phút, trong 5 phút rồi bỏ dịch nổi, thu tế bào. Tế bào đƣợc hịa đều trong mơi trƣờng DMEM (10% FBS, 100U/ml penicillin và 100 μg/ml streptomycin) rồi đƣợc cấy vào các đĩa nuôi cấy tế bào và đặt trong tủ ủ 37o
C có cung cấp 5% CO2.
Các tế bào đƣợc nuôi cấy từ 2-3 thế hệ trong 1 tuần và ln đƣợc quan sát dƣới kính hiển vi để kiểm tra mật độ và trạng thái trƣớc khi sử dụng cho các thí nghiệm hoặc có thể đƣợc lƣu giữ bằng nitơ lỏng (cho các thí nghiệm tiếp theo).
2.3.3. Đánh giá độc tính của dịch chiết mƣớp đắng và giảo cổ lam lên dòng tế bào HepG2 và HEK293 [49]
Xử lý tế bào với dịch chiết MĐ, GCL và hóa chất kiểm chứng
- Các thơng tin tóm tắt của mẫu dịch chiết MĐ và GCL đƣợc trình bày ở