Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG
2.2.2. Thiết kế các cặp mồi cho phản ứng PCR đa mồi phục vụ mục đích định lƣợng:
định lƣợng:
2.2.2.1. Phân tích HPLC với các ADN chuẩn 100 bp, 200 bp và 400 bp
- Phân tích HPLC với ADN chuẩn 100 bp, 200bp và 400 bp để lựa chọn kích thƣớc sản phẩm cần thiết kế cho phản ứng PCR đa mồi.
- Nƣớc sử dụng trong phân tích HPLC là nƣớc khử ion.
- Thành phần các hóa chất sử dụng trong phân tích HPLC (bảng 2)
Bảng 2: Thành phần hóa chất sử dụng trong phân tích HPLC
Hóa chất Thành phần
TEAA 1M Triethylamin 1M +acid acetic 1M Đệm A TEAA 0,1M + EDTA 0,1mM, pH 7,0 Đệm B TEAA 0,1M + acetonitrile 50% + EDTA
0,1mM, pH 7,8 Dung dịch bảo quản Acetonitrile 50%
- Chƣơng trình Phân tích HPLC đƣợc thực hiện theo các bƣớc sau (Hình 3)
Hình 3- Chƣơng trình phân tích HPLC - Loại cột: HotSep PLRP-S: S-167-1010, 5µ- 1000Å, - Kích thƣớc cột: đƣờng kính 1.0 mm, dài 10 cm. - Tốc độ dịng 20 µl/ phút. - Nhiệt độ buồng cột: 50oC - Đo ở bƣớc sóng 260nm.
2.2.2.2. Thiết kế các cặp primer
Để định lƣợng số bản sao mtADN chúng tôi thiết kế hai cặp primer cho phản ứng PCR đa mồi để tạo sản phẩm cho các phƣơng pháp định lƣợng sau đó. Với mục đích định lƣợng số bản sao của mtADN, chúng tôi chọn gen giữ nhà trong nhân là gen β-actin (ACTB) và đoạn gen đặc trƣng cho tính bảo thủ của mtADN đƣợc lựa chọn là ở vùng gen ND1– mã hóa cho 1 tiểu phần của Ubiquinon trong phức hệ 1
của chuỗi hô hấp của ti thể. Ngoài ra, để q trình phân tích và định lƣợng bằng HPLC đƣợc tiến hành thuận lợi, các đoạn ADN (sản phẩm PCR định lƣợng) phải đƣợc lựa chọn sao cho có sự khác biệt nhất định về kích thƣớc.
Các cặp primer đƣợc thiết kế dựa trên các trình tự gen đƣợc tham khảo trên cơ sở dữ liệu NCBI (gen β-actin: NG_007992.1; mtDNA: NC_012920.1) và phần mềm thiết kế Primer-BLAST (NCBI).
Khuếch đại đoạn gen mt và gen ACTB bằng phương pháp PCR
- Đoạn gen mt và ACTB đƣợc khuếch đại bằng phƣơng pháp PCR với thể tích 12,5 µl nhằm kiểm tra cặp mồi có nhân sản phẩm đúng kích thƣớc không.
- Phản ứng PCR với từng cặp primer mt và ACTB gồm các thành phần trong bảng 3.
Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR
Thành phần Thể tích Nờng đơ ̣ ći cùng
Phản ứng 12,5 µl Phản ứng 100 µl
Master mix Maxima 2X 6,25µl 50 µl 1X Primer F (10-5M) 0,25µl 2 µl 0,2 µM Primer R (10-5M) 0,25 µl 2 µl 0,2 µM ADN khn Tùy nồng độ ADN tổng số của mẫu 1 ng H2O siêu sạch Bổ sung đủ 12,5
µl
Bổ sung đủ 100 µl
Chu trình nhiệt đƣợc thiết lập nhƣ sau (Hình 2.2.2.3)
Hình 4- Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân đoạn gen mt và ACTB
Khuếch đại đoạn gen ti thể mt và đoạn gen nhân ACTB bằng phương pháp PCR đa mồi
- Khuếch đại bằng phản ứng PCR đoạn gen mt và ACTB với thể tích 15 µl
gồm các thành phần nhƣ trong bảng 4.
Bảng 4. Thành phần phản ứng PCR (thể tích 15 µl)
Thành phần Thể tích Nờng đơ ̣ ći cùng
Master mix Maxima 2X 7,5µl 1X Primer mt-F (10-5M) 0,3 µl 0,2 µM Primer mt-R (10-5M) 0,3 µl 0,2 µM Primer ACTB-F (10-5M) 0.3 µl 0,2 µM Primer ACTB-R (10-5M) 0.3 µl 0,2 µM
ADN khn Tùy nồng độ ADN tổng số
của mẫu 2 ng
H2O siêu sạch Bổ sung đủ 15 µl
Chu trình nhiệt đƣợc thiết lập nhƣ ở hình 4 ở trên.
Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di
Trong đệm TBE (pH 7,5 - 8.3), các phân tử acid nucleic tích điện âm nên dƣới tác dụng của dòng điện một chiều, các phân tử này sẽ chuyển động từ cực âm sang cực dƣơng. Tốc độ di chuyển của các phân tử này phụ thuộc chủ yếu vào kích
thƣớc phân tử acid nucleic, nhờ đó mà những đoạn ADN hay ARN khác nhau có khả năng phân biệt với nhau trên gel điện di. Gel điện di thƣờng sử dụng là agarose và polyacrylamide. Tùy vào kích thƣớc đoạn ADN muốn phân tách ngƣời ta sẽ sử dụng chúng ở những nồng độ khác nhau.
Kích thƣớc sản phẩm PCR đoạn gen mt là 433 bp và đoạn gen ACTB là 107
bp, nên có thể phân tích bằng điện di trên gel agarose 1.7%.
2.2.2.3. Nhân dòng đoạn gen mt và ACTB và giải trình tự ADN
Các đoạn ADN tinh sạch đƣợc nhân dòng để giải trình tự nhằm xác định trình tự của các đoạn gen.
- Tiến hành tạo đầu bằng và biến nạp đoạn mt và ACTB bằng kit CloneJET PCR Cloning Kit theo hƣớng dẫn của nhà sản xuất (vectơ đƣợc sử dụng là pJET 1.2 có kích thƣớc 2974bp. Vị trí đa điểm của vector đƣợc thiết kế nằm trong gen mã hóa cho một protein gây độc cho vi khuẩn).
- Vectơ đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E.coli DH5α.
- Các tế bào sau biến nạp thành cơng sẽ mọc trên mơi trƣờng LB đặc có chứa ampicillin.
- Các khuẩn lạc sau khi đƣợc kiểm tra đúng bằng PCR sẽ đƣợc ni với thể tích lớn 5ml trong mơi trƣờng LB có chứa ampicillin ở 37oC trong 14-16h lắc 200 vịng /phút.
- Sau đó các tế bào đƣợc thu và tách plasmid bằng QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen).
- Kiểm tra plasmid bằng điện di trên gel agarose 0,8% và đo nồng độ ADN bằng máy đo quang phổ Nanodrop.
- Plasmid thu đƣợc sẽ đƣợc kiểm tra bằng PCR với cặp mồi mt, ACTB và pJET, nếu đúng sẽ cho đoạn gen có kích thƣớc tƣơng ứng với các cặp mồi và với mồi PJet sẽ cho đoạn gen lớn hơn 120bp so với kích thƣớc của các đoạn gen tƣơng ứng.
- Kiểm tra sản phẩm PCR bằng điện di trên gel agarose 1,7%. - Mẫu plasmid sau khi tinh sạch sẽ đƣợc giải trình tự ADN.
2.2.2.4. Tinh sạch sản phẩm PCR
Plasmid sau khi dƣợc khuếch đại với thể tích lớn 100 µl sẽ đƣợc tinh sạch bằng kit thơi gel QIAquick® Gel Extraction Kit (QIAGEN, Đức)
- Kiểm tra ADN tinh sạch bằng điện di trên gel agarose 1.5 % và đo nồng độ ADN bằng máy NanoDrop.
Mẫu ADN sau khi tinh sạch đƣợc bảo quản ở -20oC để sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.