Chƣơng 3– KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ
3.2.3. Kết quả nhân dịng và giải trình tự
Tế bào khả biến đƣợc biến nạp và cấy trải trên đĩa thạch LB đặc có bổ sung ampicillin để qua đêm ở tủ ấm 37oC. Những tế bào biến nạp thành công (có chứa plasmid) sẽ phát triển và mọc thành khuẩn lạc, những tế bào không chứa plasmid sẽ chết và khơng phát triển. (Hình 10)
Hình 10- Hình ảnh khuẩn lạc sau khi plasmid đƣợc biến nạp vào tế bào E.coli DH5α.
Đĩa 1 khuẩn lạc biến nạp đoạn gen mt, đĩa 2 khuẩn lạc biến nạp đoạn gen ACTB
Các đĩa đều mọc khuẩn lạc, chứng tỏ biến nạp đã thành công, các khuẩn lạc trịn rõ ràng, khơng có dấu hiệu nhiễm.
3.2.3.1. Kết quả tách plasmid
Sau khi kiểm tra khuẩn lạc có chứa đoạn gen mong muốn bằng phƣơng pháp PCR với cặp mồi ACTB và mt, các tế bào khuẩn lạc đó đƣợc mi cấy với thể tích 5ml để tách plasmid bằng kit QIA prep Miniprep kit. Plamid đƣợc điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 11)
Qua hình ảnh điện di ta thấy các băng plasmid tƣơng đối sáng, khá gọn chứng tỏ hàm lƣợng ADN trong mẫu khá cao và sạch, đủ điều kiện để tiến hành các thí nghiệm tiếp theo.
Hình 11- Hình ảnh điện di sau khi tách plasmid.
Giếng 1 ADN chuẩn 1kb, Giếng 2 plasmid mt, giếng 3 plasmid ACTB 3.2.3.2. Kết quả PCR kiểm tra plasmid tinh sạch
Sau khi tinh sạch, các plasmid đƣợc kiểm tra bằng PCR với cặp mồi ACTB, mt và PJet. Các cặp mồi ACTB và mt sẽ nhân đƣợc các đoạn gen tƣơng ứng khoảng 107bp và 433bp, còn cặp mồi PJet ngoài nhân đoạn gen ACTB và mt mà plasmid đó chứa còn nhân thêm một đoạn 120bp của vectơ PJet 1.5, đo đó các plasmid chứa đoạn gen ACTB và mt sẽ có kích thƣớc tƣơng ứng khoảng 227bp và 553 bp. Sản phẩm đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agrose 1.7% (Hình 12)
Hình 12- Hình ảnh điện di sản phẩm PCR plasmid mt và ACTB.
Giếng 1 ADN chuẩn 100 bp; giếng 2,3 lần lượt là sản phẩm PCR plasmid ACTB với cặp mồi ACTB và PJet; giếng 4, 5 lần lượt là sản phẩm PCR plasmid mt với cặp mồi ACTB và PJet.
Kết quả điện di cho các băng tƣơng ứng với dự đoán, nhƣ vậy các plasmid tinh sạch chứa đúng đoạn gen mong muốn đã biến nạp.
Plasmid tinh sạch đƣợc đo nồng độ ADN và chuẩn bị cho việc giải trình tự.
3.2.3.3. Kết quả giải trình tự
Sử dụng phần mềm BioEdit, phần mềm Sequence Scanner 1.0 để phân tích kết quả giải trình tự. Sau đó sử dụng chƣơng trình BLAST để so sánh trình tự thu đƣợc với trình tự ADN chuẩn của ti thể (hình 13) và gen β_actin (hình 14) đã đƣợc công bố trên ngân hàng gen NCBI, chúng tơi đã xác định đƣợc kích thƣớc và trình tự đoạn gen mt và ACTB đúng với đoạn trình tự tham khảo và có kích thƣớc tƣơng ứng là 433 và 107 bp.
Hình 14- Kết quả giải trình tự plasmid có chứa đoạn ACTB
Các trình tự trên phù hợp với trình tham khảo, nhƣ vậy chúng tơi đã thiết kế đƣợc đúng các cặp mồi và nhân đƣợc đoạn gen quan tâm nhằm phục vụ mục đích định lƣợng số lƣợng bản sao mtADN.