Chƣơng 3– KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 TÁCH CHIẾT ADN TỔNG SỐ TỪ MÔ
3.3.3. Kết quả phân tích HPLC
3.3.3.1. Xây dựng đường chuẩn
Đường chuẩn với ADN chuẩn 100bp và 400bp
Các mẫu ADN chuẩn 100bp và 400bp đƣợc sử dụng để dựng đƣờng chuẩn. Các mẫu đƣợc phân tích với tỉ số ADN chuẩn 400bp/100bp theo hàm lƣợng ADN
khác nhau. Các mẫu đƣợc chạy 2 lần và thu đƣợc kết quả phân tích HPLC theo tỷ số diện tích đỉnh trung bình (Bảng 6)
Bảng 6- Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số hàm lƣợng ADN chuẩn 400bp/100bp khác nhau Tỉ số hàm lƣợng ADN 400bp/100bp 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1 Tỷ số diện tích đỉnh ADN 400bp/100bp 0,096 0,302 0,488 0,683 0,891 0.985 Tỉ số hàm lƣợng ADN 400bp/100bp 2 3 4 5 6 Tỷ số diện tích đỉnh ADN 400bp/100bp 2,037 3,062 4,153 5,113 6,102 A B
Hình 15- Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ đƣờng chuẩn tỉ số hàm lƣợng ADN chuẩn 400bp/100bp
A- Hình ảnh phân tích HPLC với tỉ số hàm lượng ADN 400bp/100bp 0.1; 0,3; 0,7; 1; 3; 6 B- Biểu đồ đường chuẩn tỉ số hàm lượng ADN mt/ACTB
Từ kết quả xây dựng đƣờng chuẩn với ADN chuẩn 100bp và 400 bp cho thấy đã thu đƣợc 1 đƣờng thẳng tuyến tính về sự phụ thuộc giữa tỷ số diện tích đỉnh 400b/100bp vào tỷ số hàm lƣợng ADN chuẩn tƣơng ứng. Hệ số tƣơng quan tuyến
từ 0,1 đến 6,0 là phù hợp cho phân tích định lƣợng ADN ti thể. Điều này chứng tỏ, phƣơng pháp HPLC đủ nhạy để sử dụng định lƣợng ADN với lƣợng mẫu nhỏ và nồng độ ADN tƣơng đối thấp, thu đƣợc kết quả có độ chính xác cao.
Đường chuẩn với băng mt/ACTB tinh sạch
Các mẫu ADN tinh sạch ACTB và mt đƣợc sử dụng để dựng đƣờng chuẩn. Các mẫu đƣợc phân tích với tỉ số mt/ACTB theo hàm lƣợng ADN lần lƣợt là 1; 0,5; 0,25; 0,125 và 0,0625. Các mẫu đƣợc phân tích 3 lần và thu đƣợc kết quả phân tích HPLC theo tỷ số diện tích đỉnh trung bình (Bảng 7)
Bảng 7 - Số liệu phân tích HPLC với các mẫu có tỉ số hàm lƣợng mt/ACTB khác nhau
Tỉ số hàm lƣợng mt/ACTB 1 0,5 0,25 0,125 0,0625 Tỷ số diện tích đỉnh mt/ACTB 0.99 0.497 0.246 0.124 0 A B
Hình 16 - Hình ảnh phân tích HPLC và biểu đồ tỉ số mt/ACTB.
A- Hình ảnh phân tích HPLC với các tỉ số hàm lượng mt/ACTB khác nhau B- Biểu đồ đường chuẩn tỉ số mt/ACTB
Dựa trên hình ảnh thu đƣợc sau khi phân tích HPLC ta có thể thấy đƣợc hai đỉnh của ADN chuẩn đƣợc rửa giải khỏi cột với thời gian lƣu khoảng giữa 35,5 - 37
phút. Mặt khác, khi phân tích với các tỉ số mt/ACTB khác nhau, diện tích các đỉnh thu đƣợc khác nhau, ta thấy đỉnh thứ hai giảm rõ ràng về diện tích, nhƣ vậy có thể khẳng định đƣợc đỉnh 1 có thời gian lƣu sớm hơn là đỉnh của băng ACTB và đỉnh thứ hai có thời gian lƣu muộn hơn là đỉnh của băng mt.
Qua biểu đồ trên ta thấy với các mẫu có tỉ số băng mt/ACTB về lƣợng khác nhau cho các kết quả rất tƣơng ứng sau khi phân tích HPLC. Với tỉ số mt/ACTB là 1/16 tƣơng ứng mẫu lên cột có 3,125 ng mt/50ng ACTB thì khơng phân biệt đƣợc đỉnh của băng mt so với đƣờng nền. Với tỉ số 1/8 tƣơng ứng mẫu lên cột có chứa 6,25 ng mt/50ng ACTB thì tỉ số về lƣợng ADN và tỉ số diện tích đỉnh của mt/ACTB đã tƣơng ứng với nhau. Nhƣ vậy với lƣợng ADN tối thiểu của mỗi băng chứa trong mẫu khi lên cột là 6,25 ng đã cho phép phân biệt đƣợc với đƣờng nền và cho kết quả tốt để định lƣợng. Đƣờng chuẩn thu đƣợc dạng tuyến tính với hệ số tƣơng quan cao (R2 = 0,9961).
3.3.3.2. Phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lượng bản sao mtADN và đặc điểm bệnh học của bệnh nhân ung thư vú
Chúng tơi đã tiến hành phân tích HPLC với các mẫu của 46 bệnh nhân nhân ung thƣ vú và 20 mẫu bệnh nhân u xơ vú. Trong đó có 46 mẫu mơ u và lân cận u của bệnh nhân ung thƣ vú, 20 mẫu mô và 19 mẫu máu của bệnh nhân u xơ vú. Các biến đổi số lƣợng bản sao mtADN (giá trị tƣơng đối) đƣợc xem xét dựa trên tỉ số mt/ACTB của các mẫu và phân tích mối liên quan với các đặc điểm bệnh học.
Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo loại mẫu
Xem xét trên hai đối tƣợng bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú, về phƣơng diện loại mẫu chúng tôi thu đƣợc kết quả ở bảng 8.
Bảng 8. Biến đổi tỉ số mt/ACTB trong các loại mẫu ở bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú
Loại mẫu Số lƣợng Trung bình tỉ số mt/ACTB P Mô lân cận u Mô u 46 46 3,6 2,6 0,0096 Mô u Mô u xơ 46 20 2,6 2,5 0,245 Mô u xơ Máu 20 19 2,5 3,1 0,11621
Chú thích: Kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney (giá trị P).
Hình 17- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình ở các loại mẫu.
Bằng cách sử dụng phƣơng pháp kiểm định phi tham số Mann-Whitney cho từng cặp nhóm mẫu ở bệnh nhân ung thƣ và bệnh nhân u xơ vú. Chúng tôi thấy ở bệnh nhân ung thƣ vú, ở mẫu mơ u có hiện tƣợng số lƣợng bản sao mtADN giảm (tỉ số mt/ACTB) so với các mẫu lân cận u, sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với với p = 0,0096 < 0,05. Nhƣ vậy, hiện tƣợng giảm số lƣợng bản sao mtADN có thể liên quan đến sự hình thành khối u ở bệnh nhân ung thƣ, có thể sự suy giảm số lƣợng bản sao này đã ảnh hƣởng đến chức năng điều hịa q trình apoptosis, giúp các tế bào đột biến gây ung thƣ thốt khỏi chết theo chƣơng trình để trở thành tế bào bất tử.
Ở bệnh nhân u xơ vú, số lƣợng bản sao mtADN ở các mẫu mơ u xơ có xu hƣớng giảm so với máu, tuy nhiên sai khác này khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05). Giữa mẫu mô u ung thƣ và mẫu mô u xơ, số lƣợng bản sao mtADN khơng có sự sai khác rõ rệt với giá trị trung bình tỉ số mt/ACTB tƣơng đƣơng nhau (p > 0,05).
Biến đổi số lượng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thư vú
Tiến hành phân tích mối liên quan giữa biến đổi số lƣợng bản sao mtADN với các đặc điểm bệnh học của các bệnh nhân ung thƣ vú, chúng tôi thu đƣợc kết quả ở bảng 9.
Bảng 9. Biến đổi tỉ số mt/ACTB và đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thƣ vú
Đặc điểm Số lƣợng Trung bình tỉ số mt/ACTB P Tuổi <50 ≥50 21 25 3,0 2,4 0,028 Độ biệt hóa Rõ Vừa Kém 2 25 10 1,81 3,42 3,34 0,108* Kích thƣớc khối u < 5cm ≥ 5cm 24 22 2,0 3,3 0,000125 Mức độ xâm lấn của khối u (T) T1,2 T3,4 35 10 2,66 2,65 0,361 Hạch di căn (N) N0 N1,2 21 24 2,45 2,83 0,1225 Giai đoạn bệnh I II III 18 3 24 2,45 2,31 2,85 0,507*
Chú thích: Giai đoạn I: T1,2N0M0; giai đoạn II: T3,4N0M0; giai đoạn III: T2-4N1,2M0; kiểm định thống kê bằng test Mann-Whitney và test Kruskal-Wallis (*) (giá trị P).
Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo nhóm tuổi bệnh nhân
Ung thƣ vú có liên quan đến sự thay đổi hormon trong cơ thể phụ nữ, vì vậy, chúng tơi chia bệnh nhân theo 2 nhóm tuổi: dƣới 50 tuổi và từ 50 tuổi trở lên (giai đoạn mãn kinh). Trong đó có 21 bệnh nhân <50 và 25 bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên, Kết quả phân tích thu đƣợc trong bảng 9, Hình 18
Hình 18- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình theo nhóm tuổi ở bệnh nhân ung thƣ vú
Kết quả ở bảng và hình trên cho thấy số lƣợng bản sao mtADN ở nhóm bệnh nhân từ 50 tuổi trở lên giảm so với nhóm dƣới 50 tuổi, sự sai khác này có ý nghĩa thống kê với p = 0,028 <0,05.
Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo kích thước khối u
Chúng tơi chia bệnh nhân thành hai nhóm tƣơng ứng với cách chia của nhiều nghiên cứu trƣớc đây ở bệnh nhân ung thƣ vú, nhóm có kích thƣớc khối u < 5cm và nhóm có kích thƣớc khối u ≥ 5 cm và thu đƣợc kết quả nhƣ bảng 3.6.6.2 (Hình 19).
Ở các mẫu của các bệnh nhân có kích thƣơc khối u lớn hơn, có tỉ số mt/ACTB lớn hơn so với các bệnh nhân có khối u < 5cm, nhƣ vậy có sự biến đổi số lƣợng bản sao mtADN tăng ở các bệnh nhân có khối u ≥ 5cm, đây là biến đổi có ý nghĩa thống kê với p = 0,000125 <0,05.
Hình 19- Biểu đồ biến đổi tỉ số mt/ACTB trung bình theo kích thƣớc khối u ở bệnh nhân ung thƣ vú.
Biến đổi số lượng bản sao mtADN theo mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và giai đoạn bệnh
Chúng tôi đã xem xét sự biến đổi số lƣợng bản sao mtADN trên nhiều khía cạnh nhƣ theo mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và theo giai đoạn bệnh và thu đƣợc kết quả trong bảng 9.
Về mức độ biệt hóa, tuy có sự sai khác lớn giữa nhóm biệt hóa rõ và hai nhóm biệt hóa vừa và kém, số lƣợng bản sao mtADN có xu hƣớng giảm ở nhóm biệt hóa rõ, tuy nhiên sự sai khác này khơng có ý nghĩa thống kê (p >0,05).
Với mức độ xâm lấn của khối u, các nhóm có sự sai khác khơng đáng kể, với tỉ số mt/ACTB trung bình là 2,66 và 2,65, sự sai khác này khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Về số hạch di căn, nhóm có hạch di căn (nhóm N1,2) có xu hƣớng biến đổi số lƣơng bản sao mtADN tăng so với nhóm khơng có hạch di căn, tuy nhiên sự sai khác này khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05)
Xét chung giai đoạn bệnh, giai đoạn I, II của bệnh có số lƣợng bản sao mtADN tƣơng đƣơng nhau, giai đoạn III có xu hƣớng biến đổi tăng so với hai giai đoạn đầu, tuy nhiên sự sai khác này cũng khơng có ý nghĩa thống kê (p > 0,05).
Qua kết quả phân tích sự biến đổi số lƣợng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thƣ vú và bệnh nhân u xơ vú bằng phƣơng pháp HPLC, chúng tôi nhận thấy khơng có sự sai khác đáng kể nào ở mẫu máu và mô u xơ ở bệnh nhân u xơ vú, cũng nhƣ ở mẫu u xơ vú và u ung thƣ, tuy nhiên ở bệnh nhân ung thƣ vú, có hiện tƣợng số lƣợng bản sao mtADN giảm ở nhóm mẫu u ung thƣ so với mẫu lân cận u, ở nhóm tuổi ≥ 50 so với nhóm tuổi < 50, và có hiện tƣợng tăng số lƣợng bản sao mtADN ở nhóm có kích thƣớc khối u lớn ≥ 5cm so với nhóm có kích thƣớc < 5cm, các sai khác này đều có ý nghĩa thống kê với p < 0,05. Xét trên mức độ biệt hóa, mức độ xâm lấn, hạch di căn và theo giai đoạn bệnh, khơng có sự khác biệt đáng kể nào. Nhƣ vậy sự biến đổi số lƣợng bản sao mtADN có liên quan đến sự hình thành khối u, sự phát tiển của khối u và tuổi của bệnh nhân.