Nghiên cứu biến đổi số lƣợng bản sao mtADN đang là một hƣớng nghiên cứu chỉ thị ung thƣ khả quan và có nhiều hứa hẹn. Các phƣơng pháp nghiên cứu đƣợc sử dụng nhiều để nghiên cứu biến đổi số lƣợng bản sao mtADN hiện nay gồm:
Phương pháp PCR định lượng
Đây là phƣơng pháp đƣợc phát triển dựa trên phƣơng pháp PCR, đƣợc sử dụng để khuếch đại và định lƣợng một đoạn ADN đích. Trong đó kết quả khuếch đại đƣợc hiển thị ngay sau mỗi chu kì phản ứng. Đo đó cho phép xác định số lƣợng
bản ADN đích đƣợc khuếch đại với độ nhạy và độ chính xác cao. kỹ thuật này đƣợc sử dụng nhiều nhất trong nghiên cứu biến đổi số lƣợng bản sao mtADN hiện nay.
PCR định lƣợng sử dụng phân tử phát huỳnh quang để ghi lại quá trình tăng lƣợng ADN đƣợc nhân lên trong phản ứng PCR tỷ lệ thuận với sự tăng tín hiệu huỳnh quang. PCR định lƣợng cho phép xác định số bản sao mtADN ban đầu có trong mẫu với độ chính xác và độ nhạy cao. Có hai kỹ thuật hay đƣợc sử dụng:
Kỹ thuật sử dụng chất nhuộm màu gắn với ADN: Chất nhuộm này có ái lực rất cao khi có sự hiện diện của sợi đơi ADN, làm cho sợi đôi ADN phát đƣợc ánh sáng huỳnh quang khi nhận đƣợc nguồn sáng kích thích.
Kỹ thuật sử dụng đầu dị oligonucleotide có gắn phân tử huỳnh quang. Khi có mặt sản phẩm khuếch đại đặc hiệu trong ống phản ứng thì sẽ có sự bắt cặp của đầu dị lên trình tự đặc hiệu của sản phẩm khuếch đại, khi đó sẽ có sự phát huỳnh quang từ ống phản ứng khi nó nhận đƣợc nguồn sáng kích thích.
Phƣơng pháp PCR định lƣợng cho phép định lƣợng đột biến mtADN với mức độ không đồng nhất thấp dƣới 1% [37].
Phương pháp HPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao) và DHPLC (sắc ký lỏng hiệu năng cao biến tính)
HPLC là một kỹ thuật trong hóa học phân tích đƣợc sử dụng để tách các thành phần trong hỗn hợp, xác định từng thành phần và định lƣợng các thành phần. Đây là một kĩ thuật cơ bản, kinh điển trong phân tích sinh học, đặc biệt trong phân tích các hợp chất hóa sinh học. Phƣơng pháp này có độ nhạy cao, có khả năng ứng dụng rộng rãi, cho phép phân tích với lƣợng mẫu nhỏ. Tuy độ nhạy và chính xác khơng đƣợc bằng phƣơng pháp PCR định lƣợng nhƣng cũng cho các kết quả định lƣợng đáng tin cậy. Bên cạnh đó ứng dụng của HPLC rất đa dạng, có thể sử dụng phân tích protein, ADN hay các hợp chất hóa học.
Phƣơng pháp RPLC-HPLC sử dụng cột sắc ký kỵ nƣớc trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN có kích thƣớc khác nhau. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ti thể, hoặc một vùng nhất định của mtADN để xác định đột biến.
Phƣơng pháp DHPLC đƣợc phát triển từ phƣơng pháp HPLC, sử dụng cột sắc ký kỵ nƣớc trên cơ sở sắc ký lỏng pha đảo để phân tách ADN dị sợi kép
(heteroduplex) vớ i đồng sợi kép (homoduplex). Các mạch ADN đƣợc phân tách ở nhiệt độ cao, sau khi hạ nhiệt độ xuống, chúng liên kết với nhau và hình thành ADN dị sợi kép chứa các cặp ghép đơi khơng chính xác. Các phân tử dị sợi kép này có thời gian di chuyển khác biệt so với sợi kép bình thƣờng. Nhiều nghiên cứu đã sử dụng phƣơng pháp này để sàng lọc toàn bộ genome ti thể, hoặc một vùng nhất định của mtADN để xác định đột biến. Phƣơng pháp DHPLC cho phép định lƣợng đột biến mtADN thấp tới 1% [11].
Phương pháp phân tích hình ảnh bản gel điện di bằng phần mềm phân tích hình ảnh.
Sự phát triển mạnh mẽ của các hệ thống phần mềm, các ứng dụng tin học đã có nhiều đóng góp to lớn trong các ngành khoa học nói chung và ngành sinh học nói riêng. Đây là phƣơng pháp đơn giản, ít tốn kém, tiện dụng, cho kết quả nhanh và có thể áp dụng rộng rãi.
Sau khi tham khảo các ƣu, nhƣợc điểm của các kỹ thuật trên và dựa trên điều kiện của phịng thí nghiệm cho phép chúng tôi ứng dụng kỹ thuật HPLC và phần mềm ImageJ để nghiên cứu biến đổi số lƣợng bản sao mtADN ở bệnh nhân ung thƣ vú. Việc kết hợp phƣơng pháp kinh điển với độ chính xác cao trong sinh học thực nghiệm là HPLC với phƣơng pháp ứng dụng phần mềm phân tích hình ảnh sẽ cho kết quả khách quan và toàn diện hơn để khảo sát sự biến đổi số lƣợng bản sao mtADN đối với bệnh nhân ung thƣ nói chung và bệnh nhân ung thƣ vú nói riêng, qua đó đánh giá đƣợc vai trị và mức độ liên quan của biến đổi đó đối với bệnh.