Chƣơng 2 ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 ĐỐI TƢỢNG
2.2.3. Định lƣợng ADN bằng HPLC và phần mềm ImageJ
2.2.3.1. Tối ưu hóa điều kiện phản ứng PCR đa mồi mt_ACTB để phục vụ mục đích định lượng:
Theo lý thuyết PCR, số bản sao đoạn gen sẽ tăng theo chu kỳ, tuy nhiên với số chu kỳ lớn hơn 40 thì sản phẩm đạt đến tình trạng bão hịa. Điều này đƣợc giải thích với các nguyên nhân chủ yếu nhƣ: nồng độ bản sao DNA tăng khiến cho lƣợng dNTP khơng đủ cung cấp; hoạt tính enzyme polymerase giảm sau nhiều chu trình thay đổi nhiệt độ. Vì vậy, việc xác định các chu kỳ mà tại đó sản phẩm PCR vẫn đang thay đổi tuyến tính mang tính quyết định tới độ chính xác của kết quả định lƣợng sau này. Đặc biệt là đối với phản ứng PCR đa mồi cịn có cả sự cạnh tranh dNTP, enzyme polymerase và không loại trừ khả năng bắt cặp giữa các cặp mồi.
Chính vì vậy, dựa vào các kết quả PCR đơn và đa mồi phía trên, chúng tơi tiến hành tìm các chu kỳ cho PCR đa mồi mà ở đó lƣợng sản phẩm vẫn đang biến đổi tuyến tính. Tiến hành PCR ở các chu kì khác nhau 20, 25, 30, 35 chu kì để chọn đƣợc chu kì PCR phù hợp (nằm trong khoảng tuyến tính).
2.2.3.2 Kiểm tra sản phẩm PCR đa mồi mt_ACTB bằng điện di
Sản phẩm PCR đƣợc điện di trên gel polyacrylamide 10% (bảng 2.2.4.2). Điện di bằng đệm TBE 1X (pH 7,5 - 8,3) ở 175 V trong 40 phút. Sau đó đƣợc nhuộm bạc và quan sát dƣới ánh sáng trắng.
Bảng 5. Công thƣ́ c đổ gel polyacrylamide 10% bản 7cm
2.2.3.3 Kỹ thuật nhuộm bạc
Bản gel sau điện di trên gel polyacrylamid đƣợc nhuộm bạc dựa trên phƣơng pháp của Bassam (1991) [3] gồm các bƣớc sau:
- Cố định bản gel bằng dung dịch acid acetic 7,5% lắc bằng máy lắc trong 20 phút. - Rửa bằng nƣớc cất ba lần, mỗi lần 5 phút.
- Nhuộm bằng dung dịch bạc nitrat trong 20 - 30 phút, lắc đều, tránh ánh sáng. - Rửa nƣớc khoảng 30 giây - 1 phút.
- Hiện băng bằng dung dịch develop (30g/L Na2CO3, 0,056% formaldehyde, 400 µg/L natri thiosulfate) trong 3- 5 phút.
- Dừng phản ứng bằng dung dịch acid acetic 7,5% trong 1 – 2 phút. - Bảo quản gel bằng nƣớc cất, quan sát kết quả bằng ánh sáng trắng.
2.2.3.4. Định lượng ADN bằng HPLC
- Các mẫu sau khi PCR đƣợc li tâm với tốc độ 13000v/phút ở 5o
C trong 15 phút để chuẩn bị phân tích bằng HPLC.
- Nƣớc sử dụng trong quá trình chạy HPLC là nƣớc khử ion. - Thành phần các hóa chất chạy HPLC ở bảng 2
- Mẫu chạy HPLC gồm 9 µl sản phẩm PCR đã li tâm, bổ sung 1 µl TEAA 1M
ph7.
- Mỗi lần phân tích HPLC, cài chƣơng trình cho bộ phận bơm mẫu tự động hút 3 µl mẫu.
- Các mẫu đƣợc phân tích theo chƣơng trình nhƣ Hình 3
Thành phần Gel 10% bản 7cm
Monoacrylamide 20% 1,65ml TBE 1X 3.3ml
APS 37,5µl TEMED 3µl
- Dựng đƣờng chuẩn với các đoạn ACTB và mt tinh sạch. - Tiến hành phân tích HPLC các mẫu PCR.
- Sau khi thực hiện xong ta sẽ có hình các đỉnh sắc ký, đựa vào phần phân tích của phần mềm LC solution kết nối với hệ thống HPLC ta sẽ tính đƣợc diện tích của các đỉnh sắc ký.
- Số lƣợng bản sao ADN ti thể (giá trị tƣơng đối) có thể tính tốn dựa theo cơng thức:
n= k. a/b
Trong đó: k: tỉ số nồng độ các cặp mồi ACTB/mt a: diện tích đỉnh của sản phẩm mt
b: diện tích đỉnh của sản phẩm ACTB
2.2.3.5. Định lượng ADN bằng phần mềm ImageJ
- ImageJ là phần mềm miễn phí, mã nguồn mở đƣợc sử dụng cho phân tích hình ảnh gel điện di. Phần mềm cho phép phân tích lƣợng ADN của các băng điện di thông qua việc xác định mật độ điểm ảnh (densitometry) của các vùng đƣợc lựa chọn phân tích của các mẫu.
- 2 µl các mẫu PCR đƣợc chạy điện di trên gel polyacrylamide 10%, 175V trong 40 phút và nhuộm bạc.
- Bản gel sẽ đƣợc scan để lấy hình ảnh sử dụng phân tích.